李三和 闸雯俊 周雷 刘凯 杨国才 游艾青

摘要：以玉针香/鄂中5号/玉晶91为材料，探讨水稻（Oryza sativa L.）花药培养过程对培养效果的影响。结果表明，以蔗糖为碳源的诱导培养基诱导，低温预处理8 d效果较好，以麦芽糖为碳源的诱导培养基诱导则预处理10 d达到最好的诱导效果，但总体以麦芽糖为碳源诱导明显好于以蔗糖为碳源诱导;早取穗和晚取穗都不利于愈伤组织的诱导;以麦芽糖做碳源的诱导培养基诱导出的愈伤组织分化效果较好，分化率较高;同一批材料中，较早诱导出的愈伤组织分化率远高于后期长出的愈伤组织。

关键词：水稻（Oryza sativa L.）;花药培养;诱导率;分化率

中图分类号：S511         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）24-0164-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.044           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： There are many factors which influence the result of rice anther culture. In this study， Yuzhenxiang/Ezhongwuhao/Yujing91 was used to reveal the influence of rice anther culture process on culture result. Young panicles pretreated in low temperature for 8 days had a good induction rate if sucrose was added into the induction medium while pretreatment with ten days had a better result if maltose was added into the induction medium， on the whole， maltose was better than sucrose in the induction period. The time of drawing young panicles effected the induction rate and too early and too late were disadvantageous to callus induction. If calluses were induced with the medium with maltose， there would have better differentiation rate than medium with sucrose. Calluses which were induced early had much higher differentiation rate than those were lately induced.

Key words： rice （Oryza sativa L.）; anther culture; induction rate; differentiation rate

水稻花药培养起始于1968年，日本Niizeki（新关）和Oono（大野）第一次获得水稻花药培养单倍体植株，1975 年中国利用花药培养育种技术第1次育成了粳稻品种单丰1 号，标志花培技术在中国常规水稻育种中开始应用。由于花药培养诱导产生的单倍体，表现出双亲性状的各种重组类型，通过自然加倍或人工处理加倍，可以在当代获得稳定的纯合二倍体。将花药培养与常规育种技术相结合，可以快速纯合有益基因，提高选择效率，缩短育种周期[1-6]。截至目前，水稻花药培养技术逐步完善，并应用于水稻遗传育种，并成为当今生物技术育种中较为成熟、实用、有效的育种新技术。各开展水稻相关基础研究的科研单位也由于研究工作的需要，希望能快速得到较大的DH群体或稳定的水稻材料，也很大程度依赖于花药培养技术。在实际操作过程中，由于受材料的差异性、培养基组分以及培养操作过程等的影响，往往获得的再生植株群体较小，使育种选择受到较大的限制或影响后续研究。因此，提高花药培养的效率，增大花培后代群体，是水稻花培研究人员共同的目标。

水稻花培技术已经有几十年的历史，但大多数都是针对粳稻，因此粳稻的花藥培养已经相对比较成熟，而籼稻的花培效率一直较低，严重影响籼稻花培育种的进程。关于如何提高花药培养的效率，国内外也有很多的文献报道，在基本培养基成分、植物生长调节剂种类和配比、低温预处理等对培养效率的影响方面进行了大量的研究[7-16]，但培养过程中包括取穗时间对诱导的影响、诱导培养基对分化的影响分化接种阶段对分化的影响等研究较少。本试验通过籼稻材料花培过程中不同诱导培养基条件下取穗时期、取穗后预处理时间、分化接种时间等对花药培养效果的影响，通过统计不同条件下愈伤组织诱导率或分化率，得到籼稻花药培养较好的培养条件，为广大花培工作者提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  植物材料  所用水稻材料为中稻籼型育种材料玉针香/鄂中五号/玉晶91。

1.1.2  培养基  以N6为诱导培养的基本培养基;以MS为分化培养的基本培养基;培养基中所用生长调节剂和脯氨酸浓度单位为mg/L;培养基的pH均为5.8。

1.2  方法

1.2.1  幼穗取材及低温预处理  幼穗取材一般于晴天上午10：00前或下午5：00后进行。选取剑叶与下一叶的叶枕距约8 cm的带苞叶稻穗，此时幼穗的颖壳宽度已接近成熟的大小，颖壳呈现淡绿色，雄蕊伸长达颖壳的1/3～1/2，花药发育处于单核中晚期。将带苞叶稻穗用湿润纱布包裹，装入保鲜袋后置于冰箱中8 ℃进行低温预处理8～10 d。

1.2.2  花药接种  无菌台上剥除稻穗苞叶，选取合适的小穗剪下，用新配制的3%次氯酸钠溶液浸泡23 min，用无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸干水后，采用剪颖抖药法将花药接至诱导培养基上，每个三角瓶约接种100个花药。

1.2.3  培养条件  诱导阶段均采取28 ℃黑暗培养。

1.2.4  统计方法  随机抽取每种试验类型诱导的材料10瓶，统计每瓶的诱导率，计算平均值得出该试验类型的愈伤组织诱导率;不同培养基诱导后的分化率则为随机抽取每种试验类型的分化材料10瓶统计分化情况，计算平均值。

2  结果与分析

2.1  取穗时期对诱导效率的影响

采用两种不同诱导培养基研究取穗时期对诱导的影响，具体结果见表2。2月28日和3月4日取穗低温处理后，不论是I3还是I7培养基，平均诱导率都低于3月1日和3月3日取穗的诱导率。也就是说过早和过晚取穗诱导效果都会变差。I7诱导率明显高于I3，最高可比I3提高49%。

2.2  预处理时间对诱导效率的影响

通过两种不同成分的诱导培养基来探讨低温预处理时间对诱导率的影响。研究结果如表3所示，不同成分的培养基对预处理时间的要求不同。以I3诱导愈伤组织时，8 ℃条件下预处理8 d达到最高诱导率13.53%;以I7诱导愈伤组织时，则预处理10 d效果最好，达到23.12%，是I3诱导时最高诱导率的1.7倍。

2.3  诱导培养基对分化的影响

采用两种不同培养基I3和I7，愈伤组织接种到相同分培养基F1上进行分化。从表4可以看出，I7诱导出的愈伤组织具有较高的绿苗分化率，分化效果较好。

2.4  分化接种时间对分化的影响

不同培养基诱导出的愈伤组织根据愈伤形成的先后分批接种到分化培养基上。从表4可以看出，最先形成的愈伤组织具有较好的胚性和分化能力，能分化出完整的花培绿色植株。随着时间推移，较晚形成的愈伤组织分化能力迅速下降，产生绿苗的能力迅速降低。

3  讨论

典型籼稻花药培养一直被认为是各种水稻类型中培养效果最差的[17，18]，探讨花药培养条件的各种文献报道也不少。由于水稻花药培养受基因型的影响太大，因此，很难得出统一的培养培养条件。本研究以玉针香/鄂中5号/玉晶91为研究材料，探讨水稻花药培养过程对培养效果的影响。结果表明，以蔗糖为碳源的诱导培养基诱导，低温预处理8 d效果较好，以麦芽糖为碳源的诱导培养基诱导则预处理10 d达到最好的诱导效果，但总体以麦芽糖为碳源诱导明显好于以蔗糖为碳源诱导;早取穗和晚取穗都不利于愈伤组织的诱导;以麦芽糖做碳源的诱导培养基诱导出的愈伤组织分化效果较好，分化率较高;同一批材料中，较早诱导出的愈伤组织分化率远高于后期长出的愈伤组织。

在水稻尤其是籼稻的花药培养中，有很多文献报道诱导阶段使用麦芽糖作为碳源有较好的效果[6，7，19]。本研究也得出相同的结论，即籼稻花药培养诱导阶段麦芽糖效果明显好于蔗糖。同时，麦芽糖作为碳源诱导出的愈伤组织具有较好的分化效果。1998年，丁世萍等[20]分析组织培养过程中麦芽糖作碳源优于蔗糖的可能原因：作为营养物，麦芽糖可在麦芽糖酶作用下分解为葡萄糖，也可在麦芽糖磷酸化酶作用下分解为葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸;蔗糖分解为葡萄糖和果糖，果糖可能对培养物有害。

从偏籼材料的低温预处理来看，9 ℃处理7～10 d有利于提高花药愈伤组织诱导频率[21]，少有研究针对不同诱导培养基探讨低温预处理时间。本研究则发现8 ℃条件下，如果使用I3培养基即用蔗糖作为碳源诱导愈伤组织，处理8 d能达到最高的诱导率，而如果选用I7培养基即用蔗糖作为碳源诱导愈伤组织，处理10 d能达到最高的诱导率。这可能与麦芽糖有较好的调节渗透压作用有关。

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