赵 昕，姜 义，赵 颖，黄 锐

(1.吉林大学第一医院 体检中心，吉林 长春130021；2.吉林大学第二医院 a.乳腺外科；b.手足外科；c.神经外科)

宫颈癌是一种常见的，严重危害妇女健康的恶性肿瘤，目前宫颈癌已超过乳腺癌居女性恶性肿瘤第一位[1]。华蟾素是从中华大蟾蜍干皮中提取得到的有效成分，主要含有吲哚生物碱、多肽、蟾蜍内脂及色素等[2,3]。实验研究和临床试验结果均证明其有抗肿瘤作用，而目前国内外关于华蟾素对宫颈癌的作用机制尚不清楚[4-6]。本研究通过观察华蟾素对HeLa细胞生长增殖的影响，从诱导细胞凋亡方向探讨华蟾素抑制HeLa生长增殖作用的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株养

宫颈癌细胞株HeLa购于上海歌凡生物科技有限公司，用含10%小牛血清的RPMI1640培养液，在含5% CO2的37 ℃培养箱中培养。

1.2 药品与试剂

华蟾素注射液购于安徽华润金蟾药业股份有限公司，小牛血清购于赛澳美细胞技术(北京)有限公司，RPMI1640培养液购于GIBCO， Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司，caspase-3抗体购于Cell Signaling Technology，β-actin购于天津津脉，BCA试剂盒、caspase-3活性检测试剂盒购于碧云天生物科技研究所，MTT购于Sigma。

1.3 MTT检测

取对数生长的HeLa细胞，调整细胞浓度至4×104/ml，加入96孔板，每孔200 μl。分别设对照组和药物组(2.5，5.0，10，20和40 μg/ml)，每个浓度设5个复孔。将细胞放置于二氧化碳培养箱中继续培养20，44和68 h，然后分别每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，继续培养4 h，吸弃上清，每孔加入150 μl DMSO溶解甲臜，震荡10 min，在570 nm波长处检测吸光度，依据下面公式计算生长抑制率。

生长抑制率(%)=(1-药物组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4 AO/EB 染色

取对数生长的HeLa细胞，调整细胞浓度加入6孔板，待细胞生长过夜后，加入不同浓度的华蟾素2.5,5和10 μg/ml作用24 h，胰酶消化收集细胞，用PBS洗涤细胞两次，然后用100 μl PBS重悬细胞，在细胞悬液中加如25 μl AO/EB混合液，混合均匀， 滴加至载玻片上，加盖玻片后立即在荧光显微镜下观察、拍照。

1.5 Annexin V-FITC 双染

取对数生长的HeLa细胞，调整细胞浓度加入6孔板，24 h后，加入不同浓度的华蟾素(2.5,5和10 μg/ml)作用24 h，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤，加入500 μl Binding Buffer重悬细胞，然后加入Annexin V 5 μl，混匀后再加入PI 5 μl ，室温、避光反应15 min，最后用流式细胞仪分析，激发波长为488 nm，发射波长为530 nm。

1.6 Western blot检测Caspase-3蛋白表达

取对数生长的HeLa细胞，调整细胞浓度加入6孔板，待细胞生长过夜后，加入不同浓度的华蟾素2.5,5和10 μg/ml作用24 h，加入 RIPA裂解液，冰上裂解30 min，然后4 ℃13 000 g 离心5 min，收集上清液。采用BCA方法测定上清液中蛋白浓度，取等量的总蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后转膜、封闭、加入caspase-3抗体，4 ℃孵育过夜，加入二抗，ECL显影，β-actin作为内部参照。

1.7 Caspase-3活性检测

取对数生长的HeLa细胞接种于6孔板，待细胞生长过夜后，加入不同浓度的华蟾素2.5,5和10 μg/ml作用24 h，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤，加入裂解液(2×106个细胞/100 μl)重悬细胞，冰浴裂解15 min，15 000 g 离心10 min，收集上清液。按照说明书要求操作， 405 nm检测吸光度，计算Caspase-3活力。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 华蟾素抑制HeLa细胞增殖

如图1所示，华蟾素在10 μg/ml时，可以明显抑制HeLa细胞生长，且生存率随着药物剂量的增加而减小，呈量效关系，24 h的IC50为12.02 μg/ml (图1)。说明华蟾素可以抑制HeLa细胞的增殖，但机制有待进一步研究。

图1 华蟾素对HeLa细胞生长增殖的影响

2.2 华蟾素诱导HeLa细胞凋亡的形态学

上面的结果提示华蟾素可以抑制HeLa细胞增殖，但具体机制尚不明确，因此我们应用AO/EB法检测华蟾素是否能够诱导HeLa细胞凋亡。如图2所示，对照组细胞的细胞核呈均一亮绿色荧光，药物处理组细胞的细胞核呈橘红色，固缩状，且随着华蟾素剂量的增加，呈橘红色荧光的细胞不断增加，提示华蟾素可以诱导HeLa细胞凋亡(图2)。

图2 华蟾素对HeLa细胞 凋亡形态学的影响

2.3 华蟾素对HeLa细胞凋亡率的影响

Annexin V-FITC染色是目前公认的灵敏，高效的凋亡细胞检测方法。因此我们采用Annexin V-FITC染色检测华蟾素对HeLa细胞凋亡率的影响。结果发现，对照组及华蟾素2.5,5和10 μg/ml作用于HeLa细胞24 h后，可明显诱导细胞凋亡，凋亡率分别为3.8%，8.1%，19.2%和30.9%(图3)。

2.4 华蟾素激活caspse-3

Caspase蛋白家族在调节细胞凋亡过程中发挥着十分关键的作用，其中caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。我们首先用Western blot检测华蟾素对caspase-3蛋白的影响。结果显示，随着华蟾素剂量的增加，caspase 3逐渐被剪切活化(图4)。接下来我们采用分光光度法检测caspase-3活性的变化。结果显示，随着华蟾素剂量的增加，caspase-3活性明显升高，呈剂量依赖关系，结果图5。

3 讨论

目前，肿瘤是严重威胁人类健康的主要疾病，化学治疗作为传统的肿瘤治疗手段仍是临床治疗肿瘤的主要方法之一。近年来，许多文献报道了华蟾素在体内和体外具有抗肿瘤作用，其机制与诱导细胞凋亡有关[7,8]。但对人宫颈癌的作用报道较少，因此本研究以人宫颈癌细胞株HeLa细胞为对象，研究华蟾素对HeLa细胞生长增殖的作用，并探讨其可能的作用机制。

我们通过体外实验发现，华蟾素能够抑制人宫颈癌细胞株HeLa生长，其抑制增殖效应呈现剂量依赖性。从1982年细胞凋亡概念提出以来一直是肿瘤研究方面的热点，因此我们以此为方向通过形态学方法检测华蟾素是否能诱导HeLa细胞凋亡。细胞凋亡是一种非常复杂的生理和病理过程，有学者发现多种化疗药物无论药物的靶点何在，它们最终都是通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到治疗目的的[9]。实验结果显示，华蟾素可以诱导HeLa细胞凋亡(图2，图3)。

细胞凋亡受到各种凋亡调控蛋白的调控，Caspase蛋白酶家族是介导细胞凋亡的一类蛋白水解酶，是细胞凋亡调控的关键分子群,其中caspase-3 是凋亡执行的重要效应分子，无论是外源性途径还是内源性途径都通过激活caspase-3，降解底物使细胞凋亡[10]。我们研究发现，华蟾素可以提高caspase-3活性，我们推测华蟾素可能是通过激活caspase-3 而进一步诱导HeLa细胞凋亡。

图3 华蟾素对HeLa细胞凋亡率的影响

图4 华蟾素对caspse-3蛋白表达的影响

图5 华蟾素对caspse-3活性的影响

总之，华蟾素可以剂量依赖的抑制人宫颈癌细胞HeLa细胞的增殖，这种效应可能与其诱导HeLa细胞凋亡的发生有关，具体的作用机制需要进一步深入探讨。

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