穆璐　　郁峰

[摘要] 目的 检测α-SMA（α-Smooth muscle actin）、ROCK-2（Rhoass ociated coiled-coil forming protein kinase-2）在缺氧缺血新生大鼠脑组织的表达，探讨Rho（Rho guanosinetriphosphatases）/ROCK信號通路的激活在新生大鼠缺氧缺血再灌注脑损伤中的意义。 方法 将SD大鼠的7 d龄新生鼠（n=48）随机分为两组：真手术组包括3个不同时段的缺氧缺血性脑病后2 h、6 h、24 h组和相对时段的假手术对照组，采用多克隆抗体免疫组织化学SP法观察α-SMA、ROCK-2的表达。 结果 假手术组在各时段α-SMA、ROCK-2表达无明显变化；HIBD组中α-SMA，ROCK-2在不同时间点呈上升趋势；ROCK-2与α-SMA的表达呈正相关。 结论 ROCK-2与α-SMA在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后随着时间表达呈上升趋势，证明ROCK-2与α-SMA参与HIBD的病理生理过程，从而说明RHO/ROCK信号通路的激活参与了新生鼠缺氧缺血性脑病的发生发展。

[关键词] 新生鼠；脑组织；缺氧缺血；ROCK-2；α-SMA

[中图分类号] R345.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）31-0033-04

Relationship between ROCK-2， α-SMA and ROCK Signaling in neonatal rats after hypoxic-ischemic reperfusion injury

MU Lu YU Feng

Department of Pediatrics， Huzhou Central Hospital in Zhejiang Province， Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To detect the expression of α-SMA（α-Smooth muscle actin） and ROCK-2（Rhoass ociated coiled-coil forming protein kinase-2） in the brain tissue of neonatal rats with hypoxia-ischemia， and to explore the significance of activation of the Rho（Rho guanosinetriphosphatases）/ROCK signaling pathway in hypoxic-ischemic reperfusion injury in neonatal rats. Methods 7-day-old neonatal rats（n=48） from SD rats were randomLy divided into two groups： the real surgery group consisted of 2， 6， and 24 hours after hypoxic ischemic encephalopathy and the sham-operated control group. The expression of α-SMA and ROCK-2 was observed by polyclonal antibody immunohistochemical SP method. Results There was no significant change in the expression of α-SMA and ROCK-2 in the sham operation group. The α-SMA and ROCK-2 in the HIBD group showed an increasing trend at different time points. ROCK-2 was positively correlated with the expression of α-SMA. Conclusion ROCK-2 and α-SMA increase with time after hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats， which proves that ROCK-2 and α-SMA participate in the pathophysiological process of HIBD， thus indicating the activation of RHO/ROCK signal pathway is involved in the development of hypoxic ischemic encephalopathy in neonatal rats.

[Key words] Newborn rats； Brain tissue； Hypoxia-ischemia； ROCK-2； α-SMA

新生儿缺氧缺血性脑病（neonatal hypoxic-ischemic encephalopat，NHIE）是因围生期窒息所导致的新生儿脑缺氧缺血损害，临床表现包括精神发育迟滞、癫痫、脑瘫及智力低下等。Rho/ROCK（Rhoass ociated coiled-coil forming protein kinase，Rho）是体内普遍存在的一条信号通路，它通过调节细胞内α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的聚合从而扮演着“分子开关”的角色[1]，参与细胞形态、粘附、迁移、增殖、凋亡、基因转录、平滑肌收缩等过程，影响细胞的极性、移动、粘附、形态改变、生长、凋亡[2]。ROCK是其重要的酶，分为ROCK-1和ROCK-2，ROCK-1主要在心脏、肺脏、骨骼肌、肾脏和胰脏等组织表达；ROCK-2主要在脑中表达[3]。目前发现ROCK的下游靶分子约有二十余种[4]，包括α-SMA、MMP、MLCP等。本课题通过新生7 d大鼠缺氧缺血脑损伤模型的建立，比较与假手术组脑组织内Rho/ROCK相关信号分子在不同时间点的表达差异，探讨该通路的激活与NHIE脑损伤的病理生理过程中的相关性。从信号转导通路途径探讨NHIE发病机制，为NHIE防治提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新生7 d SD大鼠48只（扬州大学比较医学中心），雌雄不拘，平均体重12～15 g；抗兔ROCK单克隆抗体，抗鼠α-SMA单克隆抗体，羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG（Santa公司）；ABC法免疫组化试剂盒（博士德公司）。

1.2 仪器与设备

切片机：Leica RM2135 德国；显微镜：日本尼康（Nikon）TE2000-U；纯水仪：HEAL FORCE NW 10UF 香港；移液器：Thermo Finnpipette 美国；微波炉：Galanz P7021TP-6中国；切片漂烘仪：科力飞QP-B安徽合肥电子研究所；恒温箱：上海福马GHX-9270B-1中国；干燥箱：上海精宏DHG-9140A中国；搅拌器：国华88-1中国；自动脱水机：亚光ZT-12M湖北孝感；石蜡包埋机：亚光YB-7B湖北孝感；氧浓度监测仪：上海美西智能电子仪器有限公司；超低温冰箱：青岛海尔特种电器有限公司；液氮罐：上海奥然科贸有限公司；超净工作台：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 新生7 d SD大鼠48只，随机分为两组。手术组24只：HIBD后2 h，6 h，24 h时间点各8只；假手术组24只：3个对应时点的假手术组各8只。

1.3.2 动物实验 参照RICE法[5]，手术组结扎右侧颈总动脉，术后回复30 min放入缺氧箱（氧饱和度8%～10%）2 h后，回到正常环境分别2 h、6 h、24 h取脑组织（海马、皮质）。假手术组仅游离右颈总动脉，不结扎不缺氧。

1.3.3 取材 新生大鼠乙醚麻醉，开胸后经左心室灌注固定液[（9 g/L生理盐水100 mL，40 g/L多聚甲醛，0.1 mol/L PBS（磷酸缓冲盐溶液）100 mL]，至肝脏变白及肺水肿后开颅取鼠脑组织（海马、皮质等）于固定液中固定8 h，予梯度酒精脱水、石蜡包埋，行冠状切片（4 μm）。

1.3.4 免疫组化实验 参照蔡文琴[6]方法。ROCK-2的检测，一抗为抗兔ROCK单克隆抗体（1：200，PBS稀释），ABC法后续染色；二抗为羊抗兔IgG，DAB显色；假手术对照组以PBS代替第一抗体其余同前。α-SMA的检测，一抗为抗鼠α-SMA单克隆抗体（1：200，PBS稀释），ABC法后续染色；二抗为羊抗鼠IgG，DAB显色；假手术对照组以PBS代替第一抗体，其余同前。

1.3.5 图像分析 应用Image-Pro.Plus4.0彩色病理图像分析，光学显微镜（400倍）观察，海马和皮质切片10个视野，在同一光强度下，细胞浆、胞膜染成棕黄色为阳性细胞，以单个标本为单位，选择平均光密度值为参数值。

1.4 统计学分析

处理采用SPSS 19.0完成。计量资料以（x±s）表示，两独立样本比较采用两样本t检验，各组间比较采用单因素方差分析（one-way ANVOA），多样本均数两两比较采用SNK检验，两因素间相关性分析采用直线相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新生大鼠脑组织ROCK-2免疫组化表达

ROCK-2在新生鼠大脑皮质及海马处可见黄褐色的细胞阳性表达，主要分布于神经元胞体和整个轴突部分。HIBD后6 h、24 h组ROCK-2的阳性表达较假手术组明显增多。见封三图1（放大400倍）。表1表明HIBD后2 h、6 h、24 h组ROCK-2表达平均光密度值较对应假手术组有显著性差异（P<0.05），HIBD后2 h组与6 h、24 h组间比较也有显著性差异（P<0.05），HIBD后6 h组与24 h组间比较无显著性差异（P>0.05）。

2.2 新生大鼠脑组织α-SMA免疫组化表达

见表2。α-SMA在脑组织大脑皮层及海马处均可见黄褐色的细胞阳性表达，主要分布于神经元胞体和整个轴突。HIBD后6 h、24 h组α-SMA的阳性表达较假手术组增多。新生大鼠脑组织α-SMA免疫组化表达图像见封三图2（放大400倍）。

2.3 ROCK-2与α-SMA的相关性分析

3 讨论

最近研究表明，Rho蛋白作为在信号调节中的一个关键分子，能够调节多个受体来控制多个细胞进程，比如细胞骨架重构、细胞粘附、细胞增殖、细胞运动、细胞周期调节、基因转录调控等[7]。Rho是Ras超家族中的一个亚群，由约200～300个氨基酸组成信号多肽[8]。RhoGTP酶在细胞的信号转导通路中作为信号转换器或分子开关，它有与GDP结合或GTP结合的两种失活或激活状态，前者定位在细胞浆内，而后者与细胞膜相结合。目前发现ROCK的下游靶分子约有二十余种[4]，包括MLCP、α-SMA、MMP等。深入了解Rho/ROCK信号转导途径，有助于阐明其与HIE发病发展的关系，为HIE的治疗与预后提供新的方法。

从本实验发现新生鼠HIBD后2 h、6 h、24 h组脑组织中ROCK-2的阳性表达较假手术组增多，且随着时间增加，阳性细胞呈上升趋势；且HIBD 2 h组与6 h、24 h组间比较也有显著性差异。表明在HIBD的病理生理过程中ROCK-2的表达增多且有时间依赖性的上升趋势。Rho发挥调节神经元迁移、聚集、突起的生长及抑制中枢神经再生等功能，均通过激活ROCK而实现[9，10]。Hamid等[11]通过实验动物缺血再灌注损伤模型，在缺血35 min和再灌注10 min后两个时间点测定ROCK活性，结果表明，缺血组ROCK活性没有变化，再灌注组ROCK活性增加1.7倍，从而推断ROCK活性增加主要發生在缺血后再灌注期间。

Rho蛋白作为一个关键的“分子开关”，通过一个复杂的磷酸化与去磷酸化的信号级联放大过程促使肌丝蛋白和肌动蛋白（α-SMA）互动，促进肌动蛋白微丝骨架的聚合，从而使细胞收缩[12]。通过引起细胞纤维状肌动蛋白细胞骨架改变，导致细胞之间的间隙增大、内皮通透性增高，致血浆蛋白渗出，引起组织器官水肿功能障碍。本实验显示说明α-SMA在新生鼠HIBD后6 h，24 h组中α-SMA的阳性表达较假手术组增多。HIBD 2 h组与6 h，24 h组间比较无显著性差异（P>0.05）。由此推测α-SMA作为Rho/ROCK信号通路最后的效应分子，当激活后与肌球蛋白交联促进肌动蛋白微丝骨架的聚合，从而参与了HIBD的病理生理过程。

ROCK接受Rho傳递的活化信号，发生磷酸化而激活，并介导其下游一系列底物如肌球蛋白磷酸酶、肌球蛋白轻链等磷酸化/脱磷酸化反应，使得α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）与肌球蛋白交联增加，促进肌动蛋白微丝骨架的聚合[13]。有研究发现，在肌动蛋白细胞骨架重构的调控中小G蛋白Rho/ROCK信号通路有重要的作用[14]。细胞膜肌动蛋白骨架结构的变化是调节细胞通透性的重要机制，许多炎症介质和细胞因子，如内皮素-1、血管紧张素II、白介素-1、肿瘤坏死因子（TNF）和凝血酶等均能激活RhoP/Rho激酶，使MLC磷酸化及整合素聚集，导致细胞膜收缩，通透性增加，屏障功能受损。有研究证明LPA作为Rho激动剂，可诱发神经鞘细胞α-SMA改变[14]。孙骅等[15]观察到：ROCK-1基因和蛋白随肾间质纤维化程度的加重而逐渐升高；其表达较肌成纤维细胞标志的a-SMAm RNA提前到达高峰，两者呈显著正相关。因此本实验通过测得各个时间点ROCK-2与α-SMA各自的表达量，说明ROCK-2与α-SMA的表达呈正相关，与研究结果一致。ROCK-2的活化及启动α-SMA对于HIBD中Rho/ROCK信号通路的激活是不可缺少的。

近年来随着不断的研究发现，中枢神经细胞的再生和修复是可能的，中枢神经系统可塑性（central nervous system plasticity）理论：神经在环境因素变化或受损时，具有结构和功能相应变化和修复的能力。David和Aguayo报道，在外周神经移植中，损伤的中枢神经轴突可以再生长，并提示在中枢神经内环境中存在抑制神经再生长的物质[10，16]。这些抑制因子分别为髓鞘相关糖蛋白、勿动蛋白、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白等。这些抑制因子将信号传入细胞内，导致Rho/ROCK的活化[17]。ROCK可通过肌球蛋白轻链的磷酸激酶失活的方式，使磷酸化的MLC水平上调，刺激肌球蛋白与肌动蛋白的结合，活化的肌动蛋白的解聚因子cofilin可以切断肌丝，使肌动蛋白链解聚，从而抑制轴突外生[14]。

本实验结果显示α-SMA、ROCK-2的表达水平不同时段有上升趋势，并显著高于对照组，而且两者具有显著的相关性，说明ROCK-2与α-SMA参与HIBD的病理生理过程及Rho/ROCK信号通路激活参与缺氧缺血新生大鼠的脑损伤过程。抑制RhoA和ROCK均可提高损伤后CNS的轴突再生和功能恢复。Rho/Rho激酶信号通路为治疗细胞屏障功能损伤提供了靶位点。抑制Rho/ROCK途径的法舒地尔已应用于临床，法舒地尔是目前已知的唯一能应用于临床治疗的Rho信号通路抑制剂[18]，它通过抑制细胞内肌球蛋白轻链磷酸化的水平而抑制细胞骨架功能。另外Rho激酶抑制剂可明显增加冠心病患者的运动耐量并减轻心绞痛的发作程度[19-21]，能对抗由于肝、肾移植后缺血再灌注损伤[22]。由此推测Rho/ROCK途径可能成为一个新的治疗血管疾病的治疗途径。通过对中枢神经再生的抑制分子和Rho信号通路的分析，为以后的研究及其相关临床治疗提供更多新的方法。

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（收稿日期：2018-05-30）