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蛋白质组学在皮肤毛囊发育研究中的应用

2018-02-20高丽霞王高峰刘志红

畜牧与饲料科学 2018年4期
关键词:角蛋白羊毛组学

高丽霞,王高峰,刘志红

(1.包头轻工职业技术学院乳品与农牧技术学院,内蒙古 包头 014035;2.内蒙古凉城县家畜改良工作站,内蒙古 凉城013750;3.内蒙古农业大学动物科学学院 动物遗传育种与繁殖自治区重点实验室,内蒙古 呼和浩特 010018)

蛋白质是生理功能的执行者,也是生命现象的直接体现者。功能基因组学是生命科学的研究对象,包括结构基因组的研究和蛋白质组的研究等。复杂的翻译后的修饰、蛋白质之间的相互作用等,这些现象几乎无法从mRNA水平进行判断和解释。从蛋白组进行研究,将更清楚地阐明生命在生理或病理条件下的变化机制[1]。对皮肤毛囊的蛋白质组学研究主要集中在人和小鼠上,特别是人类表皮不同基因的表达和调控研究上。

1 人类皮肤毛囊蛋白质组学研究

双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术与质谱鉴定相结合,作为一个强大的工具在分析蛋白质的表达模式上应用,应用这一工具进行皮肤蛋白质组学研究,识别目标蛋白质进而用于皮肤相关疾病的治疗。皮肤是身体最大的器官,由细胞和组织组成,能够自行生长、分化、再生。皮肤保护体内器官和系统免受外界环境的侵袭。皮肤蛋白质组学研究可以了解皮肤蛋白质的转录后修饰以及皮肤疾病发病机理等,进而解决目前棘手的皮肤疾病问题。

蛋白质数据库研究的目的是通过角质细胞进行系统的定量定性信息收集,将基因表达的异常模式提供给研究人员,最终找出信号通路和不同皮肤疾病的发病机理。到1995年时,2-DE数据库中的蛋白质增加到3 154个,已鉴定出的多肽增加到1 082个,在研究过程中进一步结合了如下程序:①已知人类蛋白的协同泳动;②2-DE凝胶免疫组化;③考马斯亮蓝染色的微序列测序;④质谱分析;⑤牛痘病毒的全称cDNA表达以及全长cDNA的体外转录与翻译[2]。在1993年,研究者将3 038个细胞蛋白质列在了人类皮肤蛋白质双向电泳数据库中,大多数蛋白对应有转录后的修饰,这些蛋白中已鉴定出来的蛋白多肽有763个,并附有SSP号、等电点、分子量、细胞定位和评价值。其中176个蛋白在数据库中有微阵列记录。

颜色和卷曲这些毛发的特征都是由基因决定的,Heywood等对发质和头发成分的差异是否受相关基因的控制展开调查。研究292个女性的头发,结果显示一串66 kDa的蛋白质与高质量的头发相关。中低分子量(14~29 kDa)的蛋白出现在染色剂的使用者以及低质量的头发试验群体中。所有受试者的氨基酸分析结果表明,毛发中丝氨酸和苏氨酸的水平有双峰频率分布,暗示其与遗传因素有关。研究数据表明,丝氨酸和苏氨酸的高水平表达量影响毛发的感官质量。此外,半胱氨酸水平较低与头发颜色、质量有关,高质量的头发可能更耐受染色剂的伤害。对头发的弹性模型研究中揭示出,高质量(4.65 GPa)毛发弹性显著高于所有中、低质量的头发(4.30 GPa)。由此得出结论,头发的成分和抗拉性能与头发的质量有关。由此假设头发质量可能是由基因决定的,了解头发的组成及其特性之间的关系,可以在未来针对每个人的头发组成,设计生产不同的产品[3]。

2 小鼠皮肤毛囊蛋白质组学研究

皮肤毛囊中的大部分蛋白,主要是角蛋白和角蛋白关联蛋白,通过变性可以将其提取出来,但由于转谷氨酰胺酶的交联调控,15%~20%的角蛋白和角蛋白关联蛋白难以得到。鸟枪法蛋白质组学现在可以鉴别异构肽蛋白质组,甚至是翻译后的修饰的蛋白质组中300个以上的成分。来源于不同细胞间的蛋白质,表明交联过程可以有效地利用可变资源产生有极大稳定性的结构。通过建立小鼠模型,研究异常毛发机理,了解蛋白组可以对蛋白缺失的毛干结构的缺陷提供研究基础。因此,通过毛发蛋白质组学研究近交系小鼠,为人类毛囊发育提供研究基础。提供一些离散的和无创伤的人类蛋白质组样本,通过对其皮肤附属物蛋白组学研究进而用于某些疾病的诊断治疗[4]。

Huang等对小鼠皮肤进行了比较蛋白组学研究,指出哺乳动物的皮肤由于经常暴露在不同的环境压力下,从而对不同压力、机体都会产生特异性的应答,通过蛋白质组分析可以评估机体蛋白质表达水平的变化。通过研究得到500多个蛋白点,建立了BALB/c小鼠皮肤的参考蛋白质组图谱,鉴定到了对应于28个不同的皮肤蛋白质的44个蛋白点。表皮中高表达的有25个蛋白质,皮下组织中表达的有9个。研究得到了在有外界压力的环境中特异性表达的功能多样的蛋白,这些功能主要包括应激反应、生长抑制、细胞凋亡、结构完整性的保持、翻译后的调控、钙结合、能量代谢、胆固醇运输和自由基的清除[5]。

Huang在小鼠皮肤蛋白质组学研究中得到了蛋白异构酶、78 kDa的葡萄糖调控蛋白前体、热激蛋白 60(heat shock protein 60,HSP60)、热激蛋白70 (heat shock protein 70,HSP70)和热激蛋白 27(heat shock protein 27,HSP27) 这 5个分子伴侣。蛋白异构酶主要在皮下组织中表达,HSP27主要在表皮表达。HSP27、HSP60以及HSP70表达水平的变化反映了皮肤对热或冷应激,暗示皮肤对温度压力的反应与这些分子伴侣有关。由此建立了大量的小鼠皮肤蛋白质组图谱参考标记,奠定了未来对表皮和皮下组织的环境应答机理的研究基础[6]。

Robert等研究表明鸟枪法可以区分不同近交系的小鼠毛干轴。分析所提供的总毛干,发现在11个小鼠品系和5个突变体中,有100多个蛋白质表达差异显著。毛干缺陷与单基因突变相关。毛干提供了一个随机的采样物种的蛋白质组,对整个表皮附属物和整个身体的重要功能研究,毛干是很好的模型[6]。

3 羊皮肤毛囊蛋白质组学研究

正皮质、中间皮质和副皮质区是羊毛的3种不同皮质层,其中有大量的细胞。研究表明,半胱氨酸浓度在副皮质区高于正皮质区。卵泡原位杂交研究表明,富含硫的蛋白最初在副皮质纤维表达,之后逐渐均匀扩散在整个纤维中表达,完成角质化的过程。相反,甘氨酸和酪氨酸含量高的蛋白质最初在正皮质囊泡中表达。研究人员采用一系列方法分离皮质层和副皮质细胞,结果显示在副皮质细胞中半胱氨酸水平更高。电泳研究发现皮质层和副皮质层细胞中有许多差异蛋白的表达,但不清楚具体是哪种蛋白质,似乎是副皮质区包含超高硫类蛋白质的比例更高。

羊毛的角质层赋予了羊毛纤维重要的特征,这些特征如手感和耐磨性均影响着羊毛纤维的内在特性和纺织性能。由于羊毛角质层中存在大量的二硫键和交联多肽,导致科研人工分离纯粹的羊毛角质层以及提取蛋白质的难度增加,清楚阐述羊毛角质层蛋白质组学非常困难。Michinari等利用2-DE技术,对韩国本地山羊羊绒进行蛋白质组学研究,发现了10种蛋白成分。质谱鉴定其中的9种蛋白成分,有3种分子量在70~120 kDa,等电点为5.3,分别为角蛋白Ⅱ型纤维、角蛋白48 kⅠ型纤维复合物8c-1和细胞溶质磷脂酶A2。另外3种蛋白成分分子量在42~50 kDa,表达量在冬季升高,分别是角蛋白Ⅰ型纤维47.6 kDa、角蛋白Ⅱ型纤维复合物7C和角蛋白Ⅱ型纤维复合物5。剩余的3种蛋白成分分子量低于17 kDa,分别是毛发角蛋白Ⅱ型中间纤维丝、角蛋白高硫基质蛋白ⅢB2(等电点5.2和5.9各1种),这些蛋白与羊毛纤维的特性均有着重要的关系[7]。

Henning等采用化学和酶消化的方法对高纯度的美利奴羊毛角质层进行蛋白组学研究,鉴定了108个蛋白点,结果表明这些蛋白点大部分属于角蛋白和非角蛋白家族,它们在分子组装和细胞结构中起重要的作用。表皮主要由角蛋白关联蛋白(keratin associated proteins,KAPs)、中间纤维丝蛋白质(intermediate filament proteins,IFPs)和细胞骨架角蛋白组成。非角蛋白结构蛋白有组蛋白、微管蛋白和细胞桥粒。由此得出结论,不同蛋白组成了角质层的结构和纤维,最重要的表皮层组成成分是角质化的蛋白家族KAPs和IFPs。

4 展望

人类一直在努力使羊毛与其他纤维特别是人工合成物相比更具竞争力,因此需要深入了解羊毛的蛋白质成分和羊毛性能之间的关系,进而指导羊的育种。首先需要获得羊毛蛋白质组图谱,通过凝胶和非凝胶技术及其他方法开发可靠的定量蛋白质表达方法。然而,要实现这一目标,面临着很多的挑战,如在羊毛蛋白质组学的应用方面,包括公共访问数据库中羊毛蛋白质序列信息的相对缺乏;羊毛纤维中众多的蛋白质中,Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白的高度同源性;角蛋白相关蛋白家族中高度的同源性和多态性;角蛋白超过其他羊毛蛋白的数量[8]。

参考文献:

[1]张奉学,王新华.蛋白质组学研究及其对中医药发展的启示[J].广州中医药大学学报,2004,21(6):486-488.

[2]HUANG C M,FOSTER K W,DESILVA T,et al.Comparative proteomic profiling of murine skin [J].The Journal of Investigative Dermatology,2003,121 (1):51-64.

[3]HEYWOOD D M, VRETTOU C, WOOD J,et al.Investigating the relationship between the hair fiber proteome and hair quality[J].International Journal of Cosmetic Science,2004,26(5):268.

[4]PLOWMAN J E, DEB-CHOUDHURY S, CLERENS S,et al.Unravelling the proteome of wool:towards markers of wool quality traits [J].Journal of Proteomic,2012,75(14):4315-4324.

[5]HUANG C M,ELMETS C A,VAN KAMPEN K R,et al.Prospective highlights of functional skin proteomics[J].Mass Spectrom Rev,2005,24(5):647-660.

[6]RICE R H.Proteomic analysis of hair shaft and nail plate[J].J Cosmet Sci,2011,62(2):229-236.

[7]YOKOHAMA M,MASUDA T,AMANO T,et al.Proteome analysis of cashmere [J].Animal Science Journal,2004,75(5):401-405.

[8]RICE R H,BRADSHAW K M,DURBIN-JOHNSON B P,et al.Differentiating inbred mouse strains from each other and those with single gene mutations using hair proteomics[J].PLoS One,2012,7(12):e51956.

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