张大鹏 冯美利 秦海棠 王永 曹红星

摘  要  为了便于研究油棕叶片的解剖结构，获得高质量的冷冻切片，对油棕叶片冷冻切片关键参数进行研究，优化了快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法。结果表明：以油棕嫩叶为实验材料，初切成2 mm×2 mm规格;冷冻包埋块为5 mm×5 mm，在-30℃冷冻速冻台上，设置冷冻箱-20℃，标本头-10℃，可切出厚度5 μm以上的冷冻切片，切片效果好。该方法可用于研究油棕叶片解剖结构的切片制作和显微观测，在油棕种质资源鉴定与评价方面有着广泛的应用价值。

关键词  油棕 ;叶片 ;冷冻切片

中图分类号  S565.9    文献标识码  A    Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.11.016

Frozen Section of Oil Palm Frond

ZHANG Dapeng  FENG Meili  QIN Haitang  WANG Yong  CAO Hongxing

（Coconut Research Institute， CATAS， Wenchang， Hainan 571339）

Abstract  In order to obtain high quality frozen section of oil palm frond to study the frond anatomical structure， the key factors related to frozen section of oil palm frond were analyzed and the frozen section of oil palm frond for quick observation of the frond anatomical structure was optimized. The results showed that the tender oil palm frond of oil palm as experimental material was cut into sections 2 mm×2 mm and embedded 5 mm×5 mm for freezing. In the  -30℃ quick-freezing table， the freezer was set at the temperature of -20℃ and the sample head was -10℃. Under this condition the frozen sections of the oil palm frond were sectioned 5 μm thick or more， with better sectioning effect. This frozen sectioning method could be used for section preparation for microscopic observation of anatomical structure of oil palm frond， and had an wide application value in identification and evaluation of oil palm germplasm resources.

Keywords  oil palm ; frond ; frozen section

油棕（Elaeis guineensis Jacq.）作为世界上产油量最高的木本油料植物之一，具有广阔的开发利用前景[1]。然而，中国油棕产业起步较晚，大多从国外引进，缺乏自主知识产权的品种[2]。引进品种需经长时间引种试种观察，才能确定能否在生产上应用。因此，有必要对油棕种质资源进行鉴定评价，择优利用。叶片解剖结构作为鉴定种质资源的重要依据之一[3-6]，其快速获取切片的方法有利于提高油棕种质资源的评价效率，在鉴定评价油棕种质方面有重要的应用价值。

石蜡切片作为植物切片的主要技术，因前处理时间长、操作繁琐等缺点[7]，不利于油棕种质资源进行大批量快速鉴定，而冷冻切片技术正好弥补了这些缺点[8]。但目前该技术的研究大多用于医疗诊断动物组织[9-12]。虽有少量植物组织冷冻切片的报道[13-15]，因不同种类的植物组织有不同特性，不同冷冻切片平台所用的内部冷冻箱和样品头等结构也有差异，实验结果虽有借鉴意义，但不能完全应用于油棕组织切片研究。因此，选择适合油棕叶片组织冷冻切片方法、流程及设置冷冻切片机中冷冻箱、样品头的温度参数尤为重要。

本研究以油棕叶片为实验材料，使用冷冻切片技术，研究快速获取油棕叶片冷冻切片的合适方法，探讨了快速获取油棕叶片组织冷冻切片的流程及冷冻切片机冷冻箱和样品头温度参數。用于油棕叶片解剖结构的分析，油棕种质资源鉴定与评价方面具有广泛的应用价值。

1  材料与方法

1.1  材料

以中国热带农业科学院椰子研究所油棕种质圃2年龄油棕苗嫩叶为切片材料，包埋剂采用美国樱花公司OCT冷冻包埋剂;冷冻切片机及显微镜型号分别为Leica CM 1900、Leica DM 2500;分析纯甘油封片。

1.2  方法

1.2.1  冷冻箱及标本头温度参数优化

冷冻切片机有3部分可以调节温度，分别为冷冻箱（0～-35℃）、速冻台（0～-45℃）、标本头（0～-50℃）。

基于前期分析，冷冻箱、速冻台和标本头的优化方案为：速冻台温度设为定量即-30℃，以便快速固定试压材料;冷冻箱、标本头设为变量，即-5、-10、-20℃，用于筛选最优温度。

1.2.2  切片厚度的对比

预制包埋盒规格为5 mm×5 mm×5 mm，将待测叶片切成2 mm×2 mm规格，将初切叶片置于已加入OCT包埋剂的包埋盒中，放置在冷凍切片机内速冻台上完成固定包埋。根据优化结果设置冷冻切片机参数，样品头上初修包埋块大小，将待切面修整为以叶片材料为中心的3 mm×3 mm规格。取5、20、40、60 μm厚度的切片，比较观片效果。

1.2.3  切片后滴加甘油的不同处理设计

用载玻片粘取切片，在加盖玻片的阶段滴加甘油封片，比较立即滴加、迟加、不加甘油3处理的观片效果，确定最佳的甘油处理。

2  结果与分析

2.1  冷冻切片机速冻台、标本头温度参数的优化及切片后效果

由表1可知。在不同温度下，冷冻包埋剂随着温度的下降硬度增强，较高（-5℃）和较低温度（-20℃）时，冷冻切片厚度均难控制。其中，冷冻箱和标本头均为-5℃时，包埋块较软;均为-20℃时，包埋块较硬，均不利于控制油棕叶片冷冻切片厚度。而标本头为-10℃、冷冻箱为-20℃条件下，可以切得厚度5 μm的切片。

高等植物中，细胞的直径通常为10～100 μm[16]。研究发现，油棕叶片表皮、栅栏和海绵组织细胞的近似直径分别约为10、25、15 μm。由此可知，厚度5 μm的切片可获得单层细胞结构，便于油棕叶片解剖结构的观察和分析。

由图1可知，经过染色处理的石蜡切片叶肉细胞较清晰，视野有分层感，获取切片的时间长;冷冻切片获取快速，视野清晰无分层感，具有良好的观测效果，可根据需要进行染色、制作永久切片。

2.2  不同厚度切片的对比

由图2可知，切片清晰程度随切片厚度的增加逐渐降低，5 μm切片（A）的解剖结构清晰可见;20 μm厚度切片（B）视野模糊，难以用于分析叶片的解剖结构;40、60 μm厚度切片（C、D）已无法用于观测。

2.3  滴加甘油的不同处理结果

由图3可知，立即滴加甘油加盖玻片（A）可以获得视野清晰、叶片结构完整的冷冻切片，有助于油棕叶片解剖结构的研究与分析;延迟滴加甘油（B）不利于盖玻片加盖，易产生气泡进而影响观测、分析和叶片解剖结构图片的获取;不滴加甘油（C）则会导致切片失水，叶片解剖结构被破坏，进而显微观测失真，不利于叶片组织内部栅栏组织、海绵组织的观测与分析。

3  讨论与结论

冷冻切片技术多用于人体或其他动物器官的医学研究[17-18]，应用于植物组织方面不多[19]。本研究所得到的参数虽可获得较好的油棕叶片切片，但仍属于初级研究阶段，与石蜡切片技术相比，还可在染色、烘干、永久切片等方面进行后续研究。因组织物理特性不同，要获得油棕的根、茎、叶、花、胚等其它组织的冷冻切片，应分别研究。本研究相关结果可作为研究其它植物叶片冷冻切片的初始操作参考，再进行优化以获得最适步骤和参数。本研究表明：以油棕鲜叶为试验材料，在冷冻速冻台设定为-30℃;冷冻箱为-20℃;标本头为-10℃条件下，可切出5 μm以上厚度的冷冻切片。该方法弥补其它切片技术所存在的组织前处理时间长、繁琐等问题，也可进行染色及永久切片处理，其获得的切片清晰完整，有利于快速分析油棕叶片解剖结构，对培育或筛选适合我国栽培的油棕种质资源具有重要的意义。

参考文献

[1] 张大鹏，王  永，石  鹏，等. 油棕组培苗Mantled变异研究进展[J]. 热带农业科学，2017，37（12）：52-55.

[2] 林位夫，曾宪海，张希财，等. 我国热区油棕种植生产潜力研究[J]. 中国科技成果，2016（24）：12，17.

[3] 李芳兰，包维楷. 植物叶片形态解剖结构对环境变化的响应与适应[J]. 植物学报，2005，22（增刊）：118-127.

[4] 伍宝朵，范  睿，胡丽松，等. 不同低温胁迫条件下胡椒叶片生理生化及结构分析[J]. 热带作物学报，2018，39（1）：66-71

[5] 何海旺，赵  明，武  鹏，等. 基于香蕉叶片解剖结构的抗寒性评价[J]. 西南农业学报，2017，30（1）：193-198.

[6] 何俊平，朱家成，王建平，等. 甘蓝型油菜幼苗显微组织结构与抗寒性的关系[J].江苏农业学报，2017，33（1）：19-26.

[7] 杨捷频. 常规石蜡切片方法的改良[J].生物学杂志，2006，23（1）：45-46.

[8] Shiraki T， Kuroda H， Takada A， et al. Intraoperative frozen section diagnosis of bile duct margin for extrahepatic cholangiocarcinoma[J].World Joural of Gastroenterol， 2018（12）： 1 332-1 342.

[9] Hashmi A A， Naz S， Edhi M M，et al. Accuracy of intraoperative frozen section for the evaluation of ovarian neoplasms： an institutional experience[J]. World Joural of Surgical Oncology， 2016（14）： 1-5.

[10] Brajkovic S， Dupouy D G， De L L， et al. Microfluidics for rapid cytokeratin immunohistochemical staining in frozen sections[J].Lab Invest， 2017（97）： 983-991.

[11] Martinelli F， Schmeler K M， Johnson C， et al. Utility of conization with frozen section for intraoperative triage prior to definitive hysterectomy[J].Gynecol Oncol， 2012， 127（2）： 307-311.

[12] Corces M R， Trevino A E， Hamilton E G， et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues[J].Nat Methods， 2017（14）： 959-962.

[13] 陳  丹，赵  洁. 适合于植物花器官的冰冻切片技术[J]. 植物科学学报，2005，23（3）：285-290.

[14] 李儒海，强  胜. 杂草果实的冰冻切片技术[J]. 植物学报，2010，45（6）：739-743.

[15] 李  贺，刘松梅，孙  艳，等. 冰冻切片技术在海滨锦葵细胞学研究中的应用[J]. 广西植物，2010，30（2）：170-173.

[16] 陆时万.植物学（上册）[C]. 北京：高等教育出版社，1992

[17] 许  平，王筱璨，陈奎生，等. 快速冰冻切片制备方法的改进[J]. 郑州大学学报（医学版），2010，45（2）：241-243.

[18] Onajin O， Wetter D A， Roenigk R K， et al. Frozen section diagnosis for non-melanoma skin cancers： correlation with permanent section diagnosis[J]. J Cutan Pathol， 2015，42（7）：459-464.

[19] 刘雪辉，张世鑫，杨  鹏，等. 一种用于观察木薯显微结构的冰冻切片技术[J]. 热带生物学报，2014，5（1）：67-72.