黄春凤 ，申红 *，夏欢 ，张雪 ，张玉栋 ，王俊刚 ，曾献存

（1石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2石河子大学农学院，新疆 石河子 832003）

乳腺炎一直是奶牛疾病研究的热点，乳腺炎常见的致病菌为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，但由于抗生素长期、大量的使用，导致这两个病原菌的耐药菌株产生，使奶牛乳腺炎难治愈、易复发，加大了奶牛乳腺炎的治疗难度，为了解决这些难题，学者们通过大量复制乳腺炎动物病理模型，对乳腺炎的致病机制和治疗药物的开发进行研究，但是奶牛作为大型经济动物，使用奶牛作为动物病理模型进行研究不仅试验费用过高、操作困难、个体差异大且无法进行实验室标准化管理，很难作为乳腺炎动物病理模型进行大量试验。1970年，Chandler使用老鼠作为试验动物，成功建立了金黄色葡萄球菌性小鼠乳腺炎病理模型[1]，此后小鼠乳腺炎病理模型被广泛应用于大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌等乳腺内感染的病理生理学及致病机理的研究[2]。小鼠已经成为国内外很多研究的病理模型，相较于奶牛等动物，小鼠具有成本低、操作方便、个体差异小、繁殖力强、利于控制试验条件和适合标准化管理等优点，小鼠属于啮齿类动物，虽然与奶牛乳腺在形态学上存在显著差异，但却是乳腺发育最典型的代表[3]，因此小鼠乳腺炎病理模型适合进行大量试验，为研发治疗奶牛乳腺感染的新药品提供研究基础。小鼠的乳腺一共有5对，其中第4对乳腺最大、最易收集和观察，因此学者们一般选用小鼠的第四对乳腺建立小鼠乳腺炎病理模型[4]。小鼠乳腺炎病理模型建立后，通过制备病理组织切片、测定乳腺组织内细菌数和TNF-α含量对其进行鉴定。目前，通过建立小鼠乳腺炎模型来研究奶牛乳腺炎的发病机制、免疫机制及治疗方法依然是最常用、最有效的方法。近年来，国内外学者们应用不同病原菌成功建立小鼠乳腺炎病理模型并取得显著地研究成果。Xiaowei Liu等[5]应用小鼠乳腺炎病理模型，研究抗菌肽DP7-C对乳腺炎的治疗效果；Demon等[6]应用小鼠乳腺炎病理模型评估新型抗生素AIC102827对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌的抗菌效果；刘萍等[7]用金黄色葡萄球菌成功诱导小鼠乳腺炎病理模型。

蝇蛆抗菌肽作为机体防御肽，具有非特异性的抗细菌、真菌、病毒等作用，且不破坏机体正常细胞，抑菌活性强，较低浓度即可抑制大部分细菌生长。

本试验用金黄色葡萄球菌诱导蝇蛆，从蝇蛆中提取抗菌肽并测定其浓度和对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及最小抑菌浓度，并用于治疗小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎，综合分析蝇蛆抗菌肽对小鼠金黄色葡萄球性乳腺炎的治疗效果，为蝇蛆抗菌肽的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

金黄色葡萄球菌由石河子大学动物科技学院传染病实验室从某牛场患有奶牛乳房炎患牛的乳样中分离、纯化、鉴定和保存。

1.1.2 试验动物

BALB/C雌鼠120只，雄鼠60只，购自石河子大学实验动物中心。雌∶雄=2∶1分笼饲养，恒温、恒湿条件下饲喂全价日粮，自由采食和饮水，饲养至雌鼠分娩。

1.1.3 主要试剂

TNF-α 检测试剂盒（e Bioscience公司），苏木精、曙红、氯化钠、酵母、琼脂、蛋白胨、酚红、普通营养琼脂培养基（LB）和高盐甘露醇鉴别培养基，由石河子大学动物科技学院生理实验室常规配置。

1.1.4 主要仪器

ZGZ-1000A恒温培养箱（上海丙林科技有限公司），组织捣碎匀浆机（海门市天龙器材试验厂），UVmini1240分光光度计（日本岛津公司），超低温冰箱（德国Thermo公司），酶标仪（美国BIOTEK公司），DP2-BSW多功能图像采集系统（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌菌液的制备

将-80℃保存的金黄色葡萄球菌接种到LB液体培养基，37℃振荡培养至对数期，取10 ml菌液8000 r/min离心5 min，弃去上清，用灭菌的生理盐水重悬菌体，8000 r/min离心5 min，弃去上清，再以灭菌的生理盐水重悬菌体（算出菌体的重量，每毫克菌体加入100 μL生理盐水稀释），混悬均匀后用平板计数法计数并计算细菌浓度，根据计数结果分别配制浓度为103CFU/50 μL的细菌悬液，4℃保存备用。

1.2.2 提取蝇蛆抗菌肽

参照陆婕等[8]方法。收集经过诱导处理的蝇蛆并弃去死蛆，自来水反复冲洗8~10次，无菌水冲洗3次，用0.1%高锰酸钾溶液消毒，无菌水冲净蛆体表面残留高锰酸钾溶液，无菌滤纸吸干蛆体体表水分并称重。按蝇蛆M(mg)∶提取液V(mL)=1∶3加入现配的蝇蛆抗菌肽提取液，将蛆体剪碎使其与粗提液充分混合，放入高速组织匀浆机中充分捣碎，于-20℃冰箱浸提过夜。取出匀浆液解冻，高速冷冻离心机4℃、12000 r/min离心30 min，取上清液重复离心3次，取上清液并在沸水浴中搅拌加热5 min后置于冰上迅速冷却10 min，高速冷冻离心机4℃、12000 r离心30 min，取上清液装入超滤离心管（截留分子量为3 kDa），浓缩液（抗菌肽粗提液）置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 蝇蛆抗菌肽粗提液浓度测定

牛血清蛋白标准溶液的配置：称取100m g牛血清蛋白，溶于100 mL的蒸馏水中。

考马斯亮蓝G-250的配置：称取100 mg考马斯亮蓝 G-250，加入 90%乙醇 50 mL，85%磷酸 100 ml，用蒸馏水定容至1000 mL。

蛋白标准曲线的制作：取7支10 mL干净的试管，分别加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL牛血清蛋白标准溶液在一次加入 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL的蒸馏水，最后加入5 mL的考马斯亮蓝G-250，充分混匀10 min中内测定光密度OD595 nm并制作标准蛋白曲线。

蝇蛆抗菌肽浓度的测定：另取2支试管，加入蝇蛆抗菌肽粗提0.1 mL，加入5 mL的考马斯亮蓝G-250，充分混匀10 min中内测定光密度OD595 nm。

1.2.4 药敏试验

根据美国国家临床实验室标准化委员会（2004，NCCLS）标准推荐的 Kirby-Bauer法(K-B法)，使用药敏纸片法测定蝇蛆抗菌肽的抑菌活性。分别取浓度为 1×108CFU/mL的金黄色葡萄球菌 20 μL接种于LB固体培养基上，无菌干燥药敏纸片（直径为6 mm）于抗菌肽粗提液中充分浸泡，取出药敏片晾干后分别贴在涂有金黄色葡萄球菌的培养基上，每种药敏纸片三个重复，恒温培养箱中37℃ 培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈的直径（Φ）大小。

判定标准：Φ≤12 mm为低敏；13<Φ<14 mm为中敏；Φ≥15 mm为高敏。

1.2.5 金黄色葡萄球菌性小鼠乳腺炎模型的建立

参照王亨等[9]方法。将 120只产后6~98 d雌鼠随机分为空白对照、生理盐水治疗组、蝇蛆抗菌肽治疗组和抗生素（环丙沙星）治疗组，每组30只。空白对照组不做任何处理，乙醚麻醉后保定，第4对乳头用75%的酒精进行消毒，然后用小镊子轻轻夹起雌鼠乳头，用微量进样器从小鼠第4对乳房的乳头旁插入，轻挑针尖平行于乳腺上方，边退边注射，每对乳腺分别注入50 μL含菌量为103CFU/50 μL的细菌悬液。

乳腺炎发病的临床判断标准：参考周晓菲等[10]评价标准，攻菌后24 h检查小鼠的乳房肿胀程度、小鼠的精神状态、被毛情况及活动量变化，如果小鼠出现精神沉郁、活动量减少、被毛杂乱，则判为发病，上述症状不明显则判为不发病。

小鼠乳腺炎治愈标准：参考周晓菲等[10]治愈标准，治疗7 d后，小鼠精神状态、饮食量和饮水量恢复正常，乳腺组织中金黄色葡萄球菌数＜102/g。

1.2.6 给药方案

小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎病理模型建立成功后，抗生素治疗组、生理盐水治疗组、蝇蛆抗菌肽治疗组分别灌胃1 g/Kg/BW环丙沙星、1.5 g/Kg/BW生理盐水和1.5 g/Kg/BW蝇蛆抗菌肽提取液，连续给药7 d，每天2次，空白对照组不做任何处理。

1.2.7 临床症状观察

观察治疗后 3、5、7 d各组小鼠的精神状态与饮食情况。

1.2.8 样品处理

分别于治疗3、5、7 d后，每组脱颈处死10只小鼠，迅速剪开腹中线，观察乳腺及周围组织的病理变化。分离第四对乳腺，一侧乳腺组织用10%中性甲醛固定24 h，制作石蜡切片，另一侧乳腺组织按1∶9（W/V）加入灭菌生理盐水，于冰上剪碎并研磨成匀浆，取匀浆液0.1 mL涂布于高盐甘露醇鉴别培养基上，37℃过夜培养后用平板计数法测定乳腺组织中金黄色葡萄球菌数，将剩余的匀浆液以12 000 r/min高速离心15 min，取上清液-80℃冰箱保存。ELISA检测乳腺组织中的肿瘤坏死因子（TNF-α），具体操作按照试剂盒说明书进行ELISA结果用Bio-RAD 550型酶标仪测定D450 nm值。

1.3 数据分析

数据统计结果用 SPSS 20.0软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 蝇蛆抗菌肽的浓度

考马斯亮蓝法测定蝇蛆抗菌肽的浓度的结果（表1），对照组蝇蛆抗菌肽浓度为 22.23 μg/mL，经金黄色葡萄球菌产生的抗菌肽的浓度为25.36 μg/mL，金黄色葡萄球菌诱导组蝇蛆抗菌肽浓度显著高于对照组（ <0.05）。

表1 各组抑菌圈直径Tab.1 Diameter of inhibition zone at different groups

2.2 蝇蛆抗菌肽的抑菌活性

K-B纸片扩散法测定蝇蛆抗菌肽的抑菌活性的结果（表1），经金黄色葡萄球菌诱导产生的蝇蛆抗菌肽、未经诱导的蝇蛆抗菌肽、抗生素（环丙沙星）对金黄色葡萄球菌均有抑制作用，金黄色葡萄球菌诱导组和抗生素（环丙沙星）组的抑菌圈直径显著大于未诱导组（ <0.05），抗生素组的抑菌圈直径显著大于金黄色葡萄球菌诱导组（ <0.05）。

2.3 小鼠临床症状观察

在治疗过程中，空白对照组小鼠精神良好，生理盐水治疗组小鼠精神萎靡不振、眼角有大量黄色分泌物、被毛凌乱，食欲、饮水量慢慢减少并于治疗第4 d食欲废绝，于第5 d早上出现老鼠死亡情况，下午老鼠全部死亡；抗菌肽治疗组和抗生素（环丙沙星）治疗组小鼠精神状态、饮食量、饮水量逐渐恢复。

2.4 病理组织学观察

小鼠乳腺组织使用HE染色制作病理组织切片，结果如图1所示。A1、A2、A3为空白对照组小鼠乳腺组织病理切片，乳腺组织结构完整；B1、B2为生理盐水组小鼠乳腺组织病理切片，乳腺腺泡分布不均匀，腺泡壁破裂，组织间隙有大量红细胞和炎性细胞浸润，乳腺结构坍塌，模糊一片，腺泡崩解、坏死；C1、C2、C3 分别为使用蝇蛆抗菌肽治疗 3、5、7d的小鼠乳腺组织病理切片，C1乳腺组织腺泡分布不均匀，腺泡壁破裂，组织间隙有大量红细胞和炎性细胞浸润，乳腺结构坍塌，模糊一片，腺泡崩解、坏死，C2乳腺组织结构破损，有炎性细胞和红细胞浸润，C3乳腺组织结构比较完整，有少量炎性细胞和红细胞浸润；D1、D2、D3分别为使用抗生素（环丙沙星）治疗 3、5、7d的小鼠乳腺组织病理切片，D1乳腺组织结构完整，有炎性细胞和红细胞浸润，D2、D3乳腺组织结构完整，有少量炎性细胞和红细胞浸润。

图1 乳腺组织病理变化Fig.1 Pathological changes in breast tissue

2.5 乳腺组织中TNF-α含量的测定结果

各试验组小鼠乳腺组织中TNF-α含量的检测结果显示（表2），在治疗过程中，抗菌肽治疗组和抗生素治疗组小鼠乳腺组织中TNF-α含量呈下降趋势，与生理盐水治疗组相比，小鼠乳腺组织中的TNF-α含量极显著下调（ ＜0.01），但是治疗结束后后，抗菌肽治疗组与抗菌素治疗组小鼠乳腺组织中的TNF-α含量仍显著高于空白对照组（ ＜0.05），说明蝇蛆抗菌肽对TNF-α有一定的抑制作用。

表2 乳腺组织中TNF-α含量Tab.2 Breast tissue TNF-α content

2.6 乳腺组织中金黄色葡萄球菌含量的测定结果

蝇蛆抗菌肽治疗小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎的过程中，平板计数法检测各试验组小鼠乳腺组织中金黄色葡萄球菌数并挑取平板中的单个菌落进行革兰氏染色，图2的结果证明小鼠乳腺炎是由金黄色葡萄球菌引起的，表3的结果显示在治疗过程中，生理盐水组小鼠乳腺组织中的金黄色葡萄球菌数量呈增长趋势，抗菌肽治疗组和抗生素治疗组小鼠乳腺组织中金黄色葡萄球菌数呈下降趋势，且治疗的第3、5 d小鼠乳腺组织中金黄色葡萄球菌数极显著低于生理盐水组（ ＜0.01），根据周晓菲等[10]治愈标准，根据小鼠乳腺组织中金黄色葡萄球菌数推算出各治疗组的治愈率，生理盐水治疗组小鼠金黄色葡萄球菌性小鼠乳腺炎的治愈率为0，抗菌肽治疗组为40%，抗生素治疗组为80%。

图2 革兰氏染色结果Fig.2 Gram stain results

表3 乳腺组织中细菌计数结果、乳腺炎发病率及小鼠死亡情况Tab.3 Results of bacterial count，incidence of mastitis and death of mice in breast tissue

3 讨论

自抗生素问世以来，抗生素被广泛应用于临床治疗动物疾病和作为饲料添加剂预防动物疾病，但是随着抗生素的广泛、大量使用，抗生素的弊端也日益增加，例如由于药物的长期刺激，使一部分致病菌产生变异、产生耐药菌株，“超级细菌”很大程度就是由于抗菌药物滥用催生出来的，另外，畜产品中的药物残留人类疾病的治疗，直接影响人类的健康，因此，寻找无毒副作用的抗生素替代品势在必行。

蝇蛆抗菌肽作为抗生素的理想替代品，既具有抗生素的促生长作用和抵抗疾病的作用，同时又克服了抗生素药物残留和易产生耐药性的缺点，是目前最具潜力及应用前景的抗菌制剂之一。

蝇蛆抗菌肽是蝇蛆经病原微生物诱导后在其体内产生的小分子生物活性物质，对大多数病原微生物都具有抑菌活性[11]，如细菌、真菌和病毒等，且这些病原菌不易对抗菌肽产生耐药性，故蝇蛆抗菌肽作为新型抗菌制剂应用于临床方面具有极大的潜力。

本试验使用金黄色葡萄球菌诱导蝇蛆产生抗菌肽，从蝇蛆中提取蝇蛆抗菌肽并测定测定蝇蛆抗菌肽浓度，结果发现从经过诱导的蝇蛆中提取到的蝇蛆抗菌肽的浓度 (25.36±1.91)显著高于未经诱导的蝇蛆(22.23±0.18)( ＜0.05)，这与王志涛、武玉飞等[11-12]研究结果结果一致。

通过K-B药敏纸片法测定蝇蛆抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，发现经金黄色葡萄球菌诱导产生的蝇蛆抗菌肽和未诱导蝇蛆抗菌肽均能抑制金黄色葡萄球菌的生长，但经金黄色葡萄球菌诱导产生的抗菌肽的抑菌圈直径(19.97±0.65)显著大于未经诱导的蝇蛆抗菌肽 (13.82±0.79)(＜0.05)，这与刘玉等[13]研究结果一致。

本试验根据刘萍等[7]试验操作，用小鼠作为试验研究动物，使用微量进样器向小鼠的第4对乳腺注射金黄色葡萄球菌细菌悬液，成功建立了金黄色葡萄球菌性小鼠乳腺炎病理模型，模拟了奶牛乳腺炎乳腺内细菌的生长环境，然后用蝇蛆抗菌肽替代传统抗生素治疗金黄色葡萄球菌性小鼠乳腺炎并进行治疗效果的评价。

在治疗各试验组小鼠第3、5和7天的过程中，抗菌肽治疗组和抗生素治疗组小鼠精神状态、饮食量和饮水量逐渐恢复，从小鼠的病理组织切片中可以观察到小鼠乳腺组织中炎性细胞和红细胞浸润逐渐减少。

TNF-α是调节炎症或与炎症反应相关的内源性介质，通常在炎症早期由受到刺激的淋巴细胞、单核巨噬细胞和内皮细胞等合成、释放，在机体的炎性应答过程中发挥着关键性的作用，被认为是炎症反应的主要细胞因子。TNF-α具有双重生物学效应，在浓度较低时，参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复及调节炎症反应，引起肿瘤细胞凋亡等；在高浓度时，过量的TNF-α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，对许多细胞都具有生物毒性作用，既可诱发细胞坏死，又可诱发细胞凋亡。为了评估蝇蛆抗菌肽的抗炎效果，本试验检测了小鼠乳腺组织中的TNF-α含量，结果显示，金黄色葡萄球菌诱导TNF-α大量表达，此结果与王亨等[9]的研究结果一致，使用蝇蛆抗菌肽小鼠乳腺炎后，小鼠乳腺组织中的TNF-α含量极显著降低(＜0.01)，结果证明，蝇蛆抗菌肽在治疗小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎时，具有明显的抗炎作用，能够降低乳腺炎组织中TNF-α的分泌，减轻其对组织的损伤，并使其维持在一定水平，参与防御反应。

小鼠乳腺组织中金黄色葡萄球菌数可以反映乳腺组织的感染细菌情况，本试验用高盐甘露醇鉴别培养基检测小鼠乳腺组织中的金黄色葡萄球菌数，发现蝇蛆抗菌肽可极显著降低小鼠乳腺组织中金黄色葡萄球菌的数量（ ＜0.01）。

综上所述，蝇蛆抗菌肽对金黄色葡萄球菌性小鼠乳腺炎具有一定的治疗效果，本研究为蝇蛆抗菌肽治疗奶牛乳腺炎提供一定的科学依据和理论基础。