罗丽 ，梁旭 ，张珂 ，王航宇 ，李国玉 ，吴霁蓂 ，黄健 ，王金辉 ，*

（1石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆 石河子 832002；2哈尔滨医科大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150081；3沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳 110016）

阿育魏实为伞形科糙果芹属植物阿育魏（L.)Sprague的干燥成熟果实，是一种传统的维吾尔药材，广泛分布于非洲至南亚等地，我国新疆喀什、和田等地引种栽培[1]。阿育魏具有很大的药用价值，被广泛用于防治人类和动物的各种疾病。它的种子已被用来作调味品，也用作香料。在维药中，主要用于高血脂症、尿路结石，皮肤瘙痒，白癜风和湿疹等[2]，还用于治疗胃癌，胃痛等胃部疾病[3]。鉴于阿魏育实显著的药理作用，许多学者对其化学成分进行了研究，研究显示阿育魏实中主要成分是挥发油，皂角苷，酚类，蛋白质，以及钙，磷，铁和烟酸[4]。其中麝香草酚(Thymol)是其挥发油的主要成分，相对含量达57.45%，Thymol具有杀菌作用，可用于化脓性感染及真菌感染或放线菌病[5]。Rethinasamy V.等[6]研究表明阿育魏实提取物具有降解黄曲霉素毒性的作用。阿育魏实中还可以用于防治尿路结石和白癜风的治疗[7]。阿育魏实乙醇提取物还具有抗氧化活性，能缓解由六六六诱发的大鼠肝内脂质过氧化反应[8]。此外，阿育魏实还用于小便不利、偏瘫和皮肤病的治疗。

从以往的研究来看，阿育魏实具有显著的药理作用。但它的药效物质基础、靶点、通路和作用机制尚不明朗。在本研究中，我们主要利用计算机辅助药物设计方法，对阿育魏实中诱导癌细胞凋亡的有效成分进行计算机辅助筛选研究。我们收集了已报道的阿育魏实的化合物，运用在线SEA方法进行靶点预测，构建关键靶蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)，miRNA-mRNA网络并进行分析，最后通过分子对接和分子动力学方法验证化合物和靶点结合能力，以期初步探索阿育魏实中诱导癌细胞凋亡的活性成分的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验药材

阿育魏实药材购自于新疆喀什，经鉴定石河子大学药学院谭勇教授鉴定为伞形科糙果芹属植物阿育魏 (L.)Sprague的干燥成熟果实。标本号为No.20071016008，保存在石河子大学药学院。

1.2 实验材料

实验用薄层色谱硅胶GF254和柱层析硅胶（200-300目）均为青岛海洋化工有限公司生产，十八烷基键合硅胶 （ODS，30-50 μm，YMC CO.Ltd.Japan)。甲醇为（色谱级，Fisher公司），其他试剂（分析纯，天津市光复精细化工研究所）。

高效液相色谱仪 (Waters 2695型泵，Waters 2998紫外检测器，美国Waters公司)；Empower II数据处理系统。

1.3 提取与分离

取干燥阿育魏实4.20 kg，依次用95%和70%乙醇 10倍、10倍、8倍量浸泡1 h，回流提取3 h，60℃减压回收溶剂得浸膏 653.0 g，再依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚萃取部分浸膏(90.0 g)，氯仿萃取浸膏 (29.0 g)，乙酸乙酯萃取浸膏(29.0 g)，正丁醇萃取浸膏 (93.0 g)。

乙酸乙酯部分经200~300目硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇溶剂系统（体积比为100∶0~0∶100）进行梯度洗脱分得13个流份分。第2个流分经硅胶柱用石油醚-丙酮系统洗脱分离得到化合物3(28.0 mg)和化合物12(5.0 mg)。第3个流份经硅胶柱以石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统洗脱并反复重结晶得到化合物11(150.0 mg)。第4个流分经硅胶柱以氯仿-乙酸乙酯-丙酮洗脱并重结晶得到化合物6(2.8 mg)。第6个流份经硅胶柱用氯仿-丙酮-甲醇洗脱并重结晶得到化合物5(2.5 mg)。以及经开放式ODS柱色谱分离和P-HPLC纯化得化合物1(7.5 mg)，7(50.7mg)，4(20.0 mg)。 正 丁 醇 部 分 经200~300目硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇溶剂系统（体积比为100∶0~0∶100）进行梯度洗脱得到14个流分。第3个流分经硅胶柱以氯仿-甲醇系统洗脱得到化合物8和化合物9。第4个流分经硅胶柱以氯仿-甲醇系统洗脱得到化合物10(10.0 mg)。第13个流分经硅胶柱以氯仿-甲醇系统洗脱得到化合物 2(4.0 mg)。

1.4 小分子化合物蛋白靶点的获取

根据化合物相似性初步筛选化合物的靶点。小分子化合物的靶蛋白是从相似性集成数据库（Similarity ensemble approach，SEA） （http：//sea.bkslab.org/）[9]获得。由于从 SEA中搜索大量数据，比较枯燥繁琐，需要粘贴大量的目标信息，所以本课题开发了一个辅助工具来简化这一过程。如果所搜索到的内容与所设置的模式相匹配，则可以利用辅助工具查看源代码和测试结果，并将它复制到缓冲区并转储到一个文件中。而后，从药物基因组学数据 库 (Pharmacogenomics Knowledgebase，PharmGKB)(http：//www.pharmgkb.org)[10]和 Universal Protein Resource (UNIPROT)(http：//www.uniprot.org)[11]获 取与蛋白相关的疾病、蛋白靶点功能聚类信息，再根据聚类分析的结果选择参与诱导癌细胞凋亡的关键靶蛋白。

1.5 构建蛋白靶点PPI网络

在此研究中，本课题利用PrePPI数据库中的数据构建靶蛋白的PPI网络。PrePPI(Prediction of Protein-Protein interactions)是一种基于三维结构信息的全基因组蛋白质相互作用计算预测方法，通过预测和验证性实验来确定人类蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interactions，PPIs)[12]的数据库。

1.6 构建目标microRNA网络

microRNAs主要通过与靶蛋白的miRNA3'-UTR端序列互补性结合，引起miRNA降解或翻译抑制来抑制靶蛋白基因的表达，从而对细胞的分化、增殖、凋亡以及致癌/抑癌等多种生物过程进行调节[13]。目前大多数研究是基于对miRNA相应的靶蛋白功能注释来推测microRNA的功能，功能明确的miRNA和靶蛋白数目并不多，因此microRNA-靶蛋白数据的挖掘成了重要的研究手段。随着生物信息学的发展，miRNA靶蛋白预测数据库也层出不穷，目前常用的靶蛋白预测数据库主要包括：miRbase、starBase、Tarbase、miRecords、TargetScan、PicTar、PITA、RNA22、miRanda、miRTarBase、miRDB、miRWalk 以及 miRGen等。本实验所研究的miRNA是从一个综合数据库miRNA（http：//www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk）[14]收集而来的，该数据库包括预测和验证的靶蛋白的microRNA。已验证的靶蛋白的microRNA网络构建由Cytoscape软件集成。

1.7 分子对接

分子对接（molecular docking)，是通过研究配体小分子与受体大分子之间的相互作用，预测它们之间结合方式和结合作用的优劣，是一种基于小分子结构新药研发设计的重要技术。它能够准确的挑选出那些与受体大分子结合位点的空间、电性特征相匹配的小分子化合物[15]。

本实验中选择已经报道有明确药效的小分子化合物作为配位体，5个靶蛋白作为受体。对接之前，从蛋白质数据库 (Protein Data Bank，PDB)(http：//www.pdb.org/pdb/home/home)下载蛋白质的初始三维结构和X射线晶体结构，利用Discovery Studio(DS)3.5程序[16]进行分子对接。

1.8 配合物的分子动力学模拟

分子动力学 (Molecular Dynamic，MD)属于基于力场的模拟方法，是分子模拟中最常用的方法。它能够动态的描述分子的运动状况，继而研究生命的动态过程。其应用领域非常广泛。就生命科学而言，它的主要应用包括：蛋白质折叠机理研究、酶催化反应机理研究、与功能相关的蛋白质运动研究、生物大分子大范围构象变化的研究等[17]。所以，分子动力学模拟对于了解分子的动态过程非常关键。

本实验中用MD模拟完成了配体-蛋白质配合物的细化。在DS3.5软件中用CHARMm力场进行配合物的分子动力学模拟，由 CDOCKER模块生成最低结合能（最负）对接构造作为MD模拟初始构象。配合物包裹在添加水分子与反离子钠和氯的简单点电场 (Simple Point Charge，SPC)环境中，以确保整个配体MD模拟系统的电中性。模拟过程可以分为五个步骤：初始化结构（使能量最小化），升温，平衡，采样和分析。为了便于操作，将这些步骤整合到一个程序("Standard Dynamics Cascade")里：首先对溶剂体系进行能量最小化，先是5000步steepest descents算法进行优化，再用5000步conjugate gradient算法优化。为了平衡系统，溶剂体系的温度会逐渐上升至300 K，在整个升温过程中溶剂会受到位置限定，最后配体在300K，1bar的环境中进行分子动力学模拟。模拟过程中用ParticalMesh Ewald(PME)进行计算，并用 SHAKE Constraint处理共价键作用。分子动力学模拟过程中，每 0.1 ns录得原子坐标。

2 结果与分析

2.1 小分子化合物和靶点蛋白质(图1，表1)

为了验证阿育魏实的分子机制，本实验首先在PubMed (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) 中收集了42个已报道的小分子化合物，同时从阿育魏实中提取并分离和鉴定其中的12个化合物(Table1)。随后，利用SEA靶点预测工具，获得243个与这12个小分子化合物相对应的靶蛋白。从结果可以看出，所有蛋白质靶标均对应多个目标化合物。一些化合物也对应多个靶标蛋白质。其次，针对所获取的靶标蛋白质，从UNIPROT数据库获取他们的蛋白功能数据，并进一步收集了仅与癌细胞凋亡有关的靶标蛋白及其功能数据。最终，从这些靶标蛋白中选择了 5个靶标蛋白(ERBB2_HUMAN，IGF1R_HUMAN，ESR1_HUMAN，NQO1_HUMAN，MMP9_HUMAN)。其所对应的化合物分别是1、10、11、12。并利用网络方法构建化合物-靶点蛋白相互作用网络(图1)。具体作用方式：化合物1和12靶向 ESR1_HUMAN，化合物10靶向 NQO1_HUMAN，ESR1_HUMAN，MMP9_HUMAN，化合物 11 靶向 ERBB2_HUMAN、IGF1R_HUMAN。这4个化合物作为潜在诱导癌细胞凋亡成分做进一步研究。

图1 化合物-蛋白质网络图Fig.1 Compound-protein network

表 1 本实验室从阿育魏实中分离到的12个小分子Tab.1 12 Compounds of the seeds of (L.)Spragu

表1 续

2.2 靶蛋白的PPI网络

靶蛋白的PPI网络见图2。

图2 蛋白质-蛋白质相互作用网络图Fig.2 PPI network

基于PrePPI，本课题构建了关于这几个靶标蛋白质的PPI网络 (图2)。通过PPI网络，可以更进一步分析1、10、11、12四个化合物可能参与与癌症相关的分子机制。从网络中可以看出：ERBB2_HUMAN、 IGF1R_HUMAN、 ESR1_HUMAN和 IBP3_HUMAN，MMP9_HUMAN，NQO1_HUMAN 分别和 6、15、413、10、2 个蛋白相互作用。

2.3 microRNA-mRNA相互作用网络

由于microRRNA在癌症中所起到的重要作用，进一步研究能够干预上述靶点蛋白ERBB2、IGF1R、ESR1、MMP9和NQO1的miRNA，本实验在miRWalk数据库中分别收集其miRNAs。从该数据库收集的ERBB2_HUMA、IGF1R_HUMAN、ESR1_HUMAN、MMP9_HUMAN、NQO1_HUMAN的已被验证过的 miRNAs个数分别为 99，63，89，3，47，9 个。然后使用这些经过验证的miRNA的靶点，构建miRNA-mRNAs网络（图3），以进一步探讨已选定靶点的分子机制。

图3 microRNA-mRNA网络Fig,3 miRNA-mRNAs networks

2.4 分子对接及分子动力学结果分析

通过分子对接和分子动力学的模拟，发现化合物11与ERBB2、IGF1R能比较好的对接。化合物11目前还没有文献报道相关的药理活性，但经过在蛋白质功能聚类分析发现其有很好的抗肿瘤的作用，如乳腺肿瘤，肺肿瘤，卵巢肿瘤，胰腺肿瘤等。化合物10与MMP9、NQO1和ESR1有较好的对接，有文献报道化合物10能够诱导癌细胞凋亡[18]，能用于乳腺癌、白血病等。化合物1、12分别能与靶点ESR1较好对接。在蛋白功能注释中发现化合物1和12都能用于诱导乳腺癌凋亡，已有文献报道化合物1能用于乳腺癌、肺炎，前列腺癌的治疗[19]，还能用于2-型糖尿病的治疗[20]。化合物12能用于结肠癌、皮肤癌、白血病的治疗[21]，对镉化氯诱导的大鼠肾毒性有保护作用[22]。分子对接的结果表明，这些化合物与靶蛋白结合的分数都很高，意味着它们确实能与靶相互作用。

为了更进一步确定上述对接结果的准确性，我们用分子动力学方法来模拟4个化合物和5个蛋白（ERBB2，ESR1，IGF1R，MMP9NQO1）所组成的化合物-蛋白质配合物的动力学性质，以进一步证实他们精确的结合机制和相互作用的稳定性。结果发现，ESR1分别和化合物1、10、12形成配合物，ERBB2和IGF1R分别与化合物 11形成配合物，MMP9、NQO1分别与和化合物10形成配合物，在整个模拟过程中均方偏差 (root-mean-square deviation，RMSD)保持稳定。在模拟过程中化合物10与NQO1形成的配合物在20 ns后达到平衡状态。值得注意的是，所有情况的最大RMSD几乎限于1.5纳米，表示所有系统的动态平衡的稳定性均可靠，并为进行进一步的分析提供了可靠的基础。其详细的复杂运动见图4。

图4 靶蛋白与化合物的docking和MDFig.4 Docking and MD of the target protein and the compound

3 讨论

众所周知，天然药物所含的化学成分一般都比较复杂，其成分的种类和含量也相差悬殊，因此天然药物一般都能和多个药物靶点相互作用，同时调控多条生物途径。对于本研究，虽然所有的预测和模拟都是通过网络和计算机平台完成，但是这些方法技术都具备充分的实践经验和理论依据，本课题组也通过计算论证了这些方法的可行性。在本研究中也确实筛选出多个已被报道的有明确治疗癌症的活性小分子。这进一步说明了阿育魏实是通过多靶点协同作用而发挥疗效的。

在世界各地，阿魏育实都作为一种常用的草药，用于人和动物疾病的防治。因此，弄清楚其活性成分的作用机制，对于开发其新药用价值非常必要。在本研究中，通过文献挖掘，整理出阿育魏实中已报到的42个小分子，并提取分离得到12个，期望预测出阿育魏实中诱导癌细胞凋亡的活性成分的分子作用机制。在本研究中通过SEA方法，在线数据库对有诱导癌细胞凋亡的关键靶蛋白进行了筛选。结果表明，化合物 1、10、11和12能与靶蛋白相互作用。我们还建立了与靶蛋白相关 PPI网络分析分子机制。另一方面，我们基于网络数据库建立了microRNA-mRNA网络。这些工作可能阐述了阿魏育实中活性成分诱导细胞凋亡更多潜在的作用机制。

为了进一步确认其分子作用机制，我们利用了分子对接和分子动力学进行了进一步对化合物和靶点的相互作用进行了验证分析。所有的计算结果表明，化合物 1、10、11、12能与靶蛋白比较好的相互作用。再加之已有文献对阿魏育实用于癌症的治疗的报道，这在某种程度上能给我们进一步研究其作用机制一些启示。