吴金秀 ，王翠喆 ，张美秀 ，顾雅娟 ，哈晓丹 ，冯家乐 ，张君 *

（1石河子大学医学院/新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832000 2石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832000）

子宫内膜癌占女性恶性肿瘤的7%[1]，是欧美等发达国家最常见的妇科恶性肿瘤，目前已接近新发妇科恶性肿瘤的50%[2]。因此，尝试阐明子宫内膜癌发生、发展的相关危险因素并明确其可能的作用机制，将为子宫内膜癌的诊断及预防提供理论依据。

肥胖是目前已知的子宫内膜癌主要的危险因素之一，肥胖主要表现为脂肪细胞体积增加及数量增多，内脏脂肪堆积，脂解作用增强，引起血浆中游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA）水平增加，最终导致脂质代谢紊乱[3]。脂质代谢的变化影响多种细胞过程，包括细胞生长、增殖和迁移[4]。FFA 过度蓄积可能是肥胖相关内膜癌发生发展的重要危险因素，而油酸（Oleic Acid，OA）是一种丰富的单不饱和脂肪酸，它会影响不同的生物过程，但其作用机制尚未完全了解。本研究通过探讨不饱和脂肪酸油酸（Oleic Acid，OA）对人子宫内膜癌细胞Ishikawa生物学行为的影响及可能机制，将为肥胖相关子宫内膜癌发展的分子机制及临床预防提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞来源

人子宫内膜癌细胞Ishikawa购自凯基生物公司。

1.2 主要试剂与仪器

1640培养基、胎牛血清以及胰蛋白酶均购自美国 Life technologies公司，OA购自美国 Sigma公司，CCK-8购自北京同仁化学研究所，Transwell小室、24孔板，96孔板购自美国Corning公司，1%结晶紫、4%多聚甲醛、Matrigel胶购自北京Solarbio公司，倒置显微镜购自日本尼康公司，酶标仪购自美国莫赛飞世尔，实时定量PCR仪购自美国ABI公司7500 Fast。

1.3 实验

1.3.1 细胞培养和分组

人子宫内膜癌细胞Ishikawa（购自凯基生物公司）用含 10%胎牛血清1640培养液，于 37℃、5%CO2孵育箱中培养。分为2组，OA（美国Sigma公司）作用组为实验组，未作任何处理的Ishikawa细胞为空白对照组。

1.3.2 细胞增殖检测

取对数生长期Ishikawa细胞，接种于96孔板（1×104个 /孔），24 h后进行 OA刺激，分为 OA刺激组，空白对照组，每组设4个复孔，并设一组无细胞对照孔。分别于刺激后 24、48、72 h和 96 h加入CCK8 溶液，每孔 10 μL，于 37 ℃、5%CO2孵育箱中培养2 h。置酶标仪检测450 nm处的吸光度值（A值），连续检测5 d，绘制不同分组Ishikawa细胞生长曲线。

1.3.3 细胞迁移实验

采用 Transwell小室，不加 Matrigel基质胶，将上述两组Ishikawa细胞制成无血清1640单细胞悬液，转移至 Transwell小室的上室（2×105个 /室），下室为含20%FBS的1640培养基。常规培养24 h后取出小室，弃去上室液体，PBS清洗后，用棉签将上室中未侵袭的细胞擦去，用4%多聚甲醛固定膜，用结晶紫染料染色15 min，晾干后置于载玻片上，在高倍显微镜下随机选取9个视野计数，取均值。实验重复3次。

1.3.4 细胞侵袭实验

采用 8 μm孔径、6.5 mm直径的 Transwell小室，用Matrigel基质胶包被Transwell小室的上室，37℃培养箱孵育2 h。将上述两组Ishikawa细胞消化并计数，用无血清1640培养基制成单细胞悬液，转移至 Transwell小室的上室（2×105个 /室），下室为含20%FBS的1640培养基。常规培养48 h后取出小室，弃去上室液体，PBS清洗后，用棉签将上室中未侵袭的细胞擦去，用4%多聚甲醛固定膜，用结晶紫染料染色15 min，晾干后置于载玻片上，在高倍显微镜下随机选取9个视野计数，取均值。实验重复3次。

1.3.5 实时定量PCR

实验组细胞刺激24 h后，收集细胞沉淀，Trizol法提取总 RNA，实时定量 PCR（real-timePCR，RT-PCR）检测mRNA表达水平。扩增引物序列及其目的片段长度见表 1。表达量以 Bcl2、Ki67、MMP1、MMP9与内参GAPDH比值表示，内参GAPDH拷贝数为 1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer Sequence Listing

1.3.6 统计学分析

应用SPSS 19.0进行统计学分析。描述分析采用表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法；若方差不齐，采用Dunnett’s T3方法。取双侧 <0.05为检验水准。

2 结果

2.1 OA最佳作用浓度的筛选

OA最佳作用浓度的筛选见图1。

图1 不同浓度OA刺激对Ishikawa细胞活性的影响Fig.1 Different concentrations of OA stimulation affect Ishikawa cell activity

细胞毒性实验结果显示，50μmol/L及200 μmol/L OA作用组Ishikawa细胞活性在48 h显著高于空白对照组，差异有统计学意义（F48 h=2.504，＜0.05），未对细胞产生毒性，用于后续实验；500 μmol/L作用组Ishikawa细胞活性在72 h和96 h低于空白对照组；1000、1500 μmol/L作用组 Ishikawa细胞活性在24、48、72、96 h均显著低于空白对照组，差异有统计学意义（F24=3.625，＜0.05；F48=9.318，<0.01；F72=36.630，<0.01；F96=47.871，<0.01），均 对 细胞产生毒性（图1）。

2.2 50、200μmol/L OA刺激对Ishikawa细胞增殖的影响

50 μmol/L OA作用 Ishikawa细胞 48 h后，细胞增殖能力显著高于空白对照组，差异有统计学差异（F48h=2.504，<0.05），200 μmol/L 作用组与空白对照组相比差异无统计学意义（图2）。

图 2 50、200 μmol/L OA刺激对 Ishikawa细胞增殖的影响Fig.2 50，200 μmol/L OA stimulation affects the proliferation of Ishikawa cells

2.3 50、200 μmol/L OA 刺激对 Ishikawa细胞迁移的影响

50 μmol/L及 200 μmol/L OA 作用 Ishikawa细胞24 h后，对穿过小室的细胞进行结晶紫染色，在高倍显微镜下随机选取9个视野计数，取均值，OA作用组穿过基膜的细胞数量（50 μmol/L：193.020±41.7646；200 μmol/L：211.852±51.9918） 显著高于空白对照组（144.944±78.1164），差异有统计学意义（ =8.993，<0.01）（图 3A、3B）。

注：a-c迁移细胞镜下图（×200），d-f Transwell小室*50 μmol/L刺激组vs空白对照组，#200 μmol/L刺激组vs空白对照组，**<0.01，##<0.01。

2.4 50、200 μmol/L OA 刺激对 Ishikawa细胞侵袭的影响

50 μmol/L及 200 μmol/L OA 作用 Ishikawa细胞48 h后，对穿过小室的细胞进行结晶紫染色，在高倍显微镜下随机选取9个视野计数，取均值，对穿过Matrigel基膜的细胞进行结晶紫染色，OA作用组穿过基膜的细胞数量（50 μmol/L：160.176±42.1348；200 μmol/L：169.167±67.2535） 显著高于空白对照组（107.821±29.0964），差异有统计学意义（ =6.560，<0.01）（图 4A、4B）。

图4 Ishikawa细胞侵袭能力的检测Fig.4 Detection of invasive ability of Ishikawa cells

2.5 50、200 μmol/L OA 作用对癌基因表达的影响

50 μmol/L OA作用 Ishikawa细胞 24h后，Bcl2、Ki67、MMP1、MMP9等基因的 mRNA表达水平与空白对照组相比均无显著差异 (>0.05)；200 μmol/L OA 作用 Ishikawa细胞 24h 后，Bcl2、Ki67、MMP9 mRNA 表达水平（2.24377±0.992222，0.03362010±0.005941518，0.068107±0.0698495） 与空白对照组（0.12427±0.271275，0.02188509±0.003112349，0.14618±0.030138）相比均显著增加，差异有统计学意义(Bcl2=7.232，<0.05；Ki67=6.245，<0.05；MMP9=3.837，<0.05)（图5）。

图5 Ishikawa细胞OA刺激24 h后，Bcl2、Ki67、MMP1、MMP9 mRNA表达水平Fig.5 After Ishikawa cells stimulated with OA for 24 h，Bcl2，Ki67，MMP1，MMP9 mRNA expression levels were detected

3 讨论

肥胖是由机体能量过剩导致，主要表现为脂肪细胞体积增大及数量增多，内脏脂肪堆积，脂解作用增强，引起血浆中游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA）水平增加，最终导致脂质代谢紊乱[5]。FFA代谢为肿瘤细胞生长增殖所必需，不仅作为能量物质，也是一种代谢调节的信号分子，它能通过参与酶转录和基因表达，调节细胞生长存活和免疫炎症反应[6-7]。高脂饮食导致的血液中FFA水平增高与子宫内膜癌的发生密切相关[8]。

油酸是人类脂肪细胞和其他组织中最常见的单不饱和脂肪酸[9-11]。油酸选择性地促进高转移癌细胞的增殖和迁移，而对低转移的癌细胞有抑制作用[12]。在高转移的胃癌细胞和乳腺癌细胞中，OA促进了其增殖和转移[12-13]。但是，增加OA的摄入可以降低结肠直肠癌（CRC）风险[14-15]。而本研究结果发现，油酸促进了人子宫内膜癌细胞Ishikawa的生长、迁移及侵袭。提示，不饱和脂肪酸OA在子宫内膜癌的发生发展过程中发挥了促癌的作用，但其具体机制尚不十分明确。

已有文献表明，与肿瘤增殖及转移有关的癌基因B细胞淋巴瘤-2基因（B-celllymphoma-2 Bcl-2）、细胞增殖核抗原（nuclcar-associated antigen Ki-67）、基质金属蛋白酶（MMPs）等在乳腺癌和子宫内膜癌中高表达[16-22]。但在肥胖相关子宫内膜癌发生发展过程中，高水平的游离脂肪酸是否通过影响上述基因的表达，继而发挥促癌作用，目前尚未见报道。Ackerman等[23]研究中发现低氧和脂肪酸代谢能为肿瘤提供一个赖以生存的微环境，具有促进肿瘤进展的作用。不饱和脂肪酸会改变肿瘤细胞内脂类的成分，导致肿瘤细胞恶性增殖和转移[24]。本研究结果显示，不饱和脂肪酸OA在促进内膜癌细胞生长、迁移及侵袭的同时，癌基因 Bcl2、Ki67、MMP1及MMP9表达水平均显著增加，提示作为细胞内信号分子的不饱和脂肪酸，可能与上述基因之间存在某种内在的联系，具体的机制值得进一步研究。

本研究初步提示，不饱和脂肪酸OA可能通过上调癌基因 Bcl2、Ki67、MMP1及 MMP9的表达，促进了子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭，其作用的具体分子机制有待进一步研究加以证实。阐明上述机制，将为明确肥胖相关子宫内膜癌发生发展和转移的机制提供理论依据，同时为肿瘤的临床治疗提供可能的靶点。