李柯，施宠，李昊宇，王文全，李阳

(新疆农业大学草业与环境科学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】镉(Cd)是备受关注的重金属元素之一，具有移动性强、毒性大、周期长、难降解等特点[1]。Cd具有较强的化学活性，是植物生长发育过程中非必需的金属元素之一，和其他重金属相比，更容易被植物吸收和积累，植物大量吸收后会产生胁迫作用，对植物种子萌发、生长发育、生理生化过程都会造成不同程度的影响[2-4]。2014年7月发布的《全国污染状况调查公报》显示，耕地点位超标率为19.4%，在无机污染物中Cd排在首位[5]。在对石河子垦区耕地土壤重金属调查和评价时，以新疆土壤背景值为评价标准，已达到重度污染水平，累积现象明显[6]。在对乌鲁木齐市南郊农田土壤镉污染进行调查时，发现南郊农田中镉含量超标的面积达到28.36%，其中两个乡的土壤镉含量平均值已经接近临界的警示值[7]。在对新疆温宿县土壤重金属含量进行评价时，就单因子潜在风险评价指数而言，重金属Cd处于中生态风险程度[8]。利用微生物，尤其是共生微生物来提高植物对重金属的耐受性从而降低重金属对植物的为害是目前国际研究的热点领域。研究重金属胁迫下内生真菌-德兰臭草共生体种子萌发和生长的影响，对解决新疆污染问题具有重要的意义。【前人研究进展】德兰臭草(Melicatranssilvanica)是禾本科臭草属多年生草本植物，主要分布于欧洲、中亚地区、俄罗斯西伯利亚等地，在我国沿天山北坡广泛分布，主要生长于海拔800～2 000 m的落叶阔叶林下或干旱灌丛中及向阳干山坡[21]。禾草内生真菌广泛存在于禾草家族中并具有多样性，在早熟禾亚科的冷季型草中分布最广[9]。有研究表明，这些禾草内生真菌赋予宿主植物很强的竞争能力，可以提高植物的抗旱性[10-12]、抗盐碱性[13-16]等。有研究报道了内生真菌和植物的共生体能增强宿主植物对重金属的耐受性，内生真菌侵染可以改善宿主高羊茅(Festucaarundinacea)的Zn耐受性[17]，也可以提高细羊茅(F.stapfii)[18]、紫羊茅(F.rubra)[19]对Al胁迫的耐受性，带菌的多年生黑麦草(Loliumperenne)可以积累更多的Cd元素[20]。【本研究切入点】2014～2018年间，沿天山北坡调查采样时发现德兰臭草都系统性地被内生真菌侵染[22]。研究利用广泛生长在天山北坡的德兰臭草，分析新疆本地土壤重金属镉污染情况。【拟解决的关键问题】以德兰臭草种子(E+)为对象，以高温干热获取不带菌种子(E-)，用不同浓度的CdCl2(5/2 H2O)对种子进行胁迫实验，研究Cd对(E+)(E-)种子萌发、植株生长生理及植株内Cd含量的变化，为评价共生微生物增强植物重金属耐性和重金属Cd污染防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

德兰臭草种子于2016年7月采自乌鲁木齐县小渠子乡(N43°34′23.52″、E87°5′4.92″、H 1387 m)。选取大小均一、饱满、色泽均匀、表皮光滑无损伤的种子。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

采用高温干热的方法获得德兰臭草不带菌(E-)种子[23]。将得到的E+和E-种子先用自来水冲洗3～4次，2%的次氯酸钠溶液振荡8 min，蒸馏水冲洗数遍，再用75%的酒精清洗5 min，在超净工作台用无菌水清洗数遍待用。

采用滤纸发芽床法进行种子萌发，运用双因素完全随机区组设计，重金属Cd胁迫，将CdCl2配成0、9、30、60、150、200、300 mg/L 7个浓度；内生真菌感染状况(E+和E-)，每个处理设置3个重复，每个培养皿中放置50粒种子，持续15 d。分别向每个培养皿中加入10 mL不同浓度的CdCl2溶液，以加蒸馏水作为对照，逐日观察种子发芽数(以胚芽长度达到种子一半为种子发芽的判断标准[24])。

1.2.2 指标测定

按照以下公式计算萌发率、发芽势、萌发指数、活力指数、根冠比、转移系数、根系耐性系数：

萌发率=(15 d发芽的种子数/种子的总数)×100%；

发芽势=(前5 d发芽的种子数/种子的总数)×100%；

发芽指数GI=∑Gt/Dt(Gt为不同时间发芽数，Dt为相应发芽天数)；

活力指数VI=GI×S[25](式中：S为种苗的鲜重，GI为发芽指数)；

根冠比=地下生物量/地上生物量[26]；

转移系数=地上部分镉含量/根部镉含量[27]；

根系耐性系数=处理组根的平均长度/对照组根的平均长度[28]。

重金属胁迫处理结束后，用直尺测量幼苗的芽长、根长；用分析天平称量每个处理的鲜重、干重。用石墨炉原子吸收法(TAS-990)测定幼苗中的重金属Cd含量。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0软件对所测数据进行统计分析，用平均值和标准误表示测定结果，采用单因素方差分析检验带菌与不带菌(E+与E-)种子间和Cd胁迫处理间的差异，采用双因素方差分析检验内生真菌感染与Cd胁迫之间的交互作用，用Duncan法对同一指标测得的数据进行多重比较。采用Excel 2003进行作图。

2 结果与分析

2.1 Cd胁迫和内生真菌感染对德兰臭草种子萌发指标的影响

不同浓度的Cd胁迫对德兰臭草种子的萌发指标都有极显著的影响(P<0.01)，内生真菌感染对德兰臭草种子发芽率、发芽势、发芽指数存在极显著影响(P<0.01)，对活力指数存在显著影响(P<0.05)。Cd胁迫与内生真菌感染之间的交互作用对萌发指标都存在极显著影响(P<0.01)。表1

随着Cd胁迫浓度的升高，德兰臭草种子的萌发指标均呈先升高后下降的趋势。当胁迫浓度为30 mg/L时，E+和E-的发芽率和发芽势都显著高于对照(P<0.05)，且E+显著高于E-(P<0.05)。当胁迫浓度大于150 mg/L时，德兰臭草种子的发芽率和发芽势普遍呈下降趋势，且均显著低于对照(P<0.05)，E+显著高于同一胁迫浓度下的E-(P<0.05)。图1，图2

E+的发芽指数和活力指数在30 mg/L浓度时均达到最大值，分别为54.91、7.39，且显著高于对照(P<0.05)。E-的发芽指数在60 mg/L浓度时达到最大值，为50.19；E-的活力指数在30 mg/L浓度时达到最大值，为7.11，二者均显著高于对照(P<0.05)。胁迫浓度在150 mg/L以上时的发芽指数和活力指数均显著低于对照(P<0.05)。同一胁迫浓度下，除了60 mg/L，其余E+的发芽指数都显著高于E-(P<0.05)。30 mg/L以上的胁迫浓度时，E+种子的活力指数显著低于对照(P<0.05)。胁迫浓度低于150 mg/L时，E+种子的活力指数显著高于同一浓度下的E-(P<0.05)。图3，图4

表1 内生真菌感染和重金属 Cd 胁迫处理对德兰臭草影响的双因素方差

Table1Two-wayANOVAoftheinfluenceofendophyteinfectionandCd2+stressonMelicatranssilvanica

变量Variable内生真菌感染Endophyte infection镉胁迫Cd2+ stress交互作用InteractionFSig.FSig.FSig.发芽率 Germination rate82.81**1 191.62**18.57**发芽势 Germination potential76.00**280.88**12.04**发芽指数 Germination index104.55**648.89**9.53**活力指数 Vitality index7.41*487.75**6.75**芽长 Bud length112.26**4 620.05**49.12**根长 Root length28.17**1 613.90**10.613**幼芽鲜重 Bud fresh weight0.99NS352.18**13.40**幼根鲜重 Root fresh weight11.44**100.01**5.07**幼芽干重 Bud dry weight25.09**89.71**6.20**幼根干重 Root dry weight10.60**232.64**7.08**根冠比 Root-shoot ratio0.065NS57.41**25.589**幼芽重金属Cd含量 Cd2+ content467.52**4 126.88**38.26**幼根重金属Cd含量 Cd2+ content100.27**711.18**12.94**镉转移系数 Cd transfer coefficient6.505*837.868**0.759NS根系耐性系数 Root tolerance coefficient25.33**1 349.37**121.63**

注：NS表示差异不显著，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)

Note: NS indicates that the difference is not significant,* indicates that the difference is significant(P<0.05), ** indicates that the difference is very significant(P<0.01)

图1 不同浓度Cd胁迫下内生真菌感染对德兰臭草种子发芽率变化

Fig.1 Effect of endophyte infection on germination rate ofMelicatranssilvanicaunderdifferentCd2+concentrations

图2 不同浓度Cd胁迫下内生真菌感染对德兰臭草种子发芽势变化

Fig.2 Effect of endophyte infection on germination percentage ofMelicatranssilvanicaunderdifferentCd2+concentrations

图3 不同浓度Cd胁迫下内生真菌感染对德兰臭草种子发芽指数变化

Fig.3 Effect of endophyte infection on germination index ofMelicatranssilvanicaunderdifferentCd2+concentrations

图4 不同浓度Cd胁迫下内生真菌感染对德兰臭草种子活力指数变化

Fig. 4 Effect of endophyte infection on vitality index ofMelicatranssilvanicaunderdifferentCd2+concentrations

2.2 Cd胁迫和内生真菌感染对德兰臭草幼苗生长的的影响

研究表明，不同浓度的Cd胁迫对德兰臭草幼苗的生长指标都有极显著的影响(P<0.01)。内生真菌感染对德兰臭草幼苗的芽长、根长、幼芽干重、幼根鲜重、幼根干重都具有极显著的影响(P<0.01)，对活力指数和Cd转移系数具有显著影响(P<0.05)，对幼苗的幼芽鲜重和根冠比没有显著影响(P<0.05)。Cd胁迫和内生真菌感染的交互作用除对Cd转移系数没有显著影响外，对德兰臭草幼苗其余的测定指标都存在极显著的影响(P<0.01)。

随着胁迫浓度的升高，德兰臭草幼苗的芽长都显著低于对照(P<0.05)，根长除9 mg/L外，都显著低于对照(P<0.05)。同一胁迫浓度下，E+芽长显著高于E-(P<0.05)。9 mg/L胁迫浓度时，E+和E-根长都显著高于对照，且E+高于E-，但二者之间不存在显著性差异(P<0.05)。

当胁迫浓度为9 mg/L时，E+幼芽鲜重和幼根鲜重都显著高于对照(P<0.05)，而E-只有幼根鲜重显著高于对照(P<0.05)；在30 mg/L的胁迫浓度时，E-的幼芽鲜重显著高于对照(P<0.05)，且显著高于E+(P<0.05)；幼根鲜重在60 mg/L的胁迫浓度时，E-显著高于对照(P<0.05)，且显著高于E+(P<0.05)；60 mg/L以上，幼芽和幼根鲜重都显著低于对照(P<0.05)。

随着胁迫浓度的升高，幼芽干重和幼根干重都呈现增加的趋势，都显著高于对照(P<0.05)。胁迫浓度在30 mg/L时，E-芽长干重大于E+，但二者之间不存在显著性差异(P<0.05)。在胁迫浓度为60 mg/L时，E+的幼芽和幼根干重都显著大于E-(P<0.05)。随着胁迫浓度的增加，幼苗的根冠比呈现逐渐增大的趋势，在胁迫浓度为9和60 mg/L时，E+的根冠比显著低于E-(P<0.05)。胁迫浓度在150 mg/L及以下时，随着胁迫浓度的升高，Cd转移系数逐渐增大，且任何两个浓度之间都具有显著性差异(P<0.05)。浓度小于150 mg/L时，E-的转移系数高于同一浓度下的E+，但二者之间不存在显著性差异(P<0.05)，当胁迫浓度达到150 mg/L时，E-转移系数显著高于E+(P<0.05)。当胁迫浓度为9 mg/L时，根系耐性系数>1。当胁迫浓度为30 mg/L时，E+的根系耐性系数显著高于E-(P<0.05)，其余浓度下，E+的根系耐性系数高于E-，但二者之间不存在显著性差异(P<0.05)。表2

2.3 不同Cd2+处理下内生真菌感染对德兰臭草幼苗中Cd2+含量的影响

不同浓度的镉胁迫和内生真菌感染都显著影响了德兰臭草幼苗中的Cd2+含量(P<0.05)，且二者之间的交互作用对德兰臭草幼苗中的Cd2+含量具有极显著的影响(P<0.01)，研究表明，不同胁迫浓度下，幼芽、幼根重金属含量都显著高于对照(P<0.05)。随着胁迫浓度的升高，幼芽中的重金属含量呈现增加的趋势。同一胁迫浓度下，德兰臭草幼根中的重金属含量显著高于幼芽(P<0.05)，幼芽E-显著高于E+(P<0.05)。胁迫浓度小于150 mg/L时，E-幼根中的重金属含量均显著高于E+(P<0.05)。表3

3 讨 论

3.1 Cd胁迫和内生真菌感染对德兰臭草种子萌发指标的影响

植物生长在重金属污染的环境介质中，会吸收过量的重金属，从而对植物的膜系统造成一定程度的为害，进一步会影响植物各细胞器的结构和功能[29]。镉是一种毒性很强的重金属，高浓度的镉胁迫会扰乱水分平衡、降低细胞膜的通透性，导致细胞损伤，进而抑制植物生长发育[30-31]。研究在对种子萌发指标的评价中，发现在胁迫浓度低于30 mg/L时，种子的萌发指标都高于对照，高浓度下强烈抑制种子萌发。这与刘雪云[32]、周秋峰[33]等得出的结论一致。周秋峰等[33]发现在25 mg/L Cd2+胁迫下，在一定程度上促进小麦种子的萌发，高浓度胁迫对小麦种子萌发产生了强烈的抑制作用；刘雪云等[32]发现在1 mg/kg时，可以刺激天蓝苜蓿的生长，高浓度Cd对天蓝苜蓿产生了毒害作用，影响了呼吸作用和生长代谢。在低浓度胁迫下，植物可通过排斥、固定、抗氧化酶、络合等达到解毒作用，重金属离子可刺激金属硫蛋白和植物螯合态的合成，从而促进胁迫蛋白的合成与积累[34]。随着胁迫浓度的升高，植物蛋白酶和淀粉酶的活性会受到抑制，从而植物代谢所需要的物质和能量都会受到影响，最终会导致种子萌发受到抑制[35]。研究种子萌发指标表现出"低促高抑"的现象，可能是因为低浓度胁迫促进了胁迫蛋白的合成与积累，高浓度胁迫抑制了植物所需的物质和能量的合成，最终导致种子萌发收到抑制。

表3 不同Cd2+处理下内生真菌感染下德兰臭草幼苗中Cd2+含量变化

Table 3 Effects of endophyte infection on Cd2+ content of Melica transsilvanica under different Cd2+ concentrations

不同植株镉含量(mg/kg)镉处理 Cd2+ concentration (mg/L)093060150200300幼芽Bud dryE+-32.49±0.88k63.75±1.57i73.18±1.79h112.41±1.99d97.92±2.31e138.80±0.52aE--42.30±1.46i85.00±2.86g93.20±4.30f124.70±2.93b119.98±0.61c139.69±2.13a幼根Root dryE+-259.88±22.78d237.02±4.91e298.98±0.56c219.68±2.13e339.65±1.46b-E--312.78±12.41c309.19±6.83c368.93±1.53a232.15±1.36e--

注：同列、同行不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)

Note: Different small letters in the same column and the same line indicate significant difference (P<0.05)

3.2 Cd胁迫和内生真菌感染对德兰臭草幼苗生长的的影响

根系是植物吸收养分和水分的重要器官，其形态直接或间接影响地上部的生长和发育[36]。王喆和王强[37]研究指出，当Cd对植物产生毒害作用时，会表现在根部的形态和生理功能的改变上。研究中当胁迫浓度大于30 mg/L时，主根长度逐渐减小，达到200 mg/L以上时，主根不再生长。刘建新[38]在对玉米幼苗的研究中有相似的结论，发现当胁迫浓度大于50 mg/L时，根系长度减小。植物的根部直接接触镉溶液，吸收的镉不易向地上部分运输而积累在根部，活性氧大量积累，导致膜脂过氧化和脱脂化，进而影响细胞正常的生理功能[39]。研究中根冠比随着Cd胁迫浓度的增加逐渐增大，且胁迫浓度达到150 mg/L以上时，幼芽的生长速率明显高于幼根，表明根系吸收了大量的重金属，阻碍了重金属离子向地上部分的迁移，减少了对芽的损伤，最终导致根受抑制的程度大于芽的受抑制程度[40]。研究中随着胁迫浓度的升高，无论是幼芽还是幼根，干物质的量都呈现增加的趋势，重金属胁迫使宿主增加了干物质的积累。可能是因为种子萌发时，胚根最先突破种皮，并始终完全与胁迫液接触，导致其根尖细胞受到伤害，从而影响水分和养分的吸收及向上运输，从而影响幼芽、幼根伸长及造成干物质的积累[41]。植物对重金属的转移系数表示植物对重金属的转移能力，与植物的生理生化等因素密切相关[42]。研究中，胁迫浓度在150 mg/L及以下时，随着胁迫浓度的升高，Cd转移系数逐渐增大，到达地上部分的Cd越多，对地上部分的毒害作用越大。

有研究报道内生真菌的侵染有效缓解了Cd毒害对醉马草(Achnatheruminebrians)、披碱草(Elymusdahuricus)种子萌发和幼苗生长的影响[43-44]。研究发现种子的萌发指标及芽长、根长，E+显著高于E-(P<0.05)，且E-的转移系数高于E+，表明内生真菌的侵染有效缓解了Cd对德兰臭草种子萌发和生长的毒害作用。

3.3 不同Cd2+处理下内生真菌感染对德兰臭草幼苗中Cd2+含量的影响

有学者研究发现内生真菌感染会导致高羊茅植物根系分泌物中酚类物质含量的增加[45]，进一步的研究发现高羊茅根系分泌物会使铝、铜等重金属的毒性显著降低[46-47]。研究发现内生真菌侵染可以降低德兰臭草E+幼苗中的Cd2+的含量。同一胁迫浓度下德兰臭草幼根中的重金属含量显著高于幼芽，E-显著高于E+(P<0.05)表明内生真菌显著降低了根系中镉的含量，可能是因为内生真菌促进德兰臭草根部分泌了更多的酚类物质，减少了镉在根部的积累，进一步降低了植株整体的镉含量。

4 结 论

4.1 Cd胁迫浓度低于30 mg/L时，种子的萌发指标均高于对照；胁迫浓度高于30 mg/L时，种子的各萌发指标呈下降趋势，胁迫浓度达到200 mg/L以上时，强烈抑制种子萌发。

4.2 随着胁迫浓度的升高，无论是幼芽还是幼根，干物质的量都呈现增加的趋势，且Cd转移系数逐渐增大。

4.3 胁迫浓度小于150 mg/L时，E+的发芽率、发芽势、活力指数均显著高于同一浓度下的E-(P<0.05)而且德兰臭草幼根中的重金属含量显著高于同一浓度下的幼芽(P<0.05)，E-植株中的Cd含量显著高于E+植株(P<0.05)。内生真菌的侵染有效缓解了Cd对德兰臭草种子萌发和生长的毒害作用，进一步证实了共生微生物能增强宿主德兰臭草对重金属Cd的耐受性。