肖 巍

（辽宁省固沙造林研究所，辽宁阜新 123000）

近几十年，植物组织培养技术不断成熟并迅速发展，应用领域和范围不断扩大。特别是在林木育种中，面对生态环境的恶化、林木种苗需求的增大、珍稀树种的扩繁等问题，植物组织培养可以利用其外植体用量少、繁殖速度快等特点对林木树种进行快速繁殖。但是，在离体培养及试管苗生根等方面，存在初接种污染高、离体培养物褐化、退化严重、增殖系数低等问题一直未能得到有效解决[1-3]。尤其是高大的乔木树种，还面临着污染率高、褐化率高等问题。因此，现以核桃楸植物组织为例，总结归纳植物组织培养中常见问题，以供参考。

1 污染问题

在植物组织培养中，普遍存在材料、接种和培养过程三类污染。

1.1 材料污染 植物组织培养因外植体材料带来的污染很常见，原因主要是外植体种类、取材时间和外植体消毒处理方式选择不当。

1.1.1 外植体种类 外植体的生长状态很重要，会严重影响组培苗的生长。所以，要采集生长健壮、无明显病虫害的外植体材料。不同的植物器官在组织培养过程中难易程度有一定差异，常用的植物组织器官有叶片、茎段、未成熟胚。

1.1.2 外植体的取材时间 植物组织培养应选用当年萌发幼嫩的外植体，取材时间一般集中在3-5月。相比于其他时间段，3-5月的外植体萌发率高且污染率低。植条应在连续3个晴天后采集，采集当天天气晴朗，因降雨情况下采集会增大外植体在组织培养当中的污染率。一天中的采集时间也很重要，应选择阳光充足的时间段，利用紫外线可杀死外植体表面的部分细菌，以达到降低污染率的目的，所以一般选择11：00-15：00为宜。

1.1.3 外植体的消毒处理 保证组培苗在无菌条件下生长，是植物组织培养成功的关键因素之一，所以对于外植体的消毒试剂和消毒时间选择很重要。在林木育种组织培养时，常用的消毒试剂有次氯酸钠和酒精配合升汞使用。例如，在组培核桃楸时，酒精配合升汞消毒效果比次氯酸钠配合升汞更好。消毒时间的选择也很重要，消毒时间过长会影响外植体生长，消毒时间过短往往达不到最佳消毒效果。

1.2 接种污染 接种培养过程中的污染，主要是由操作环境、操作工具和操作人员造成的。

1.2.1 操作环境造成的污染 植物组织培养时，无菌环境非常重要。在操作之前，要对无菌室和操作台进行酒精和紫外线消毒，以防止试验材料被污染。

1.2.2 操作工具造成的污染 在试验操作过程中，由于操作工具直接接触外植体，因此在试验中操作工具的消毒尤为重要。对于试验中用到的工具能够高压灭菌的，要放入高压灭菌锅内进行灭菌，其他工具要进行酒精和紫外线杀菌。

1.2.3 操作人员造成的污染 人员进入组培室前，要穿上已经消毒的白外套。操作过程中，先用酒精棉对双手消毒，然后严格按照流程要求操作，避免说话。

1.3 培养过程污染 培养瓶应在接种之后放置于培养室中。培养瓶中的外植体在室温环境下进行呼吸作用，通过培养瓶盖上的滤膜进行气体交换。培养环境不清洁，空气湿度过高，培养室内污染苗过多，都会造成外植体污染。因此，要定期对培养室进行消毒，非实验人员不得随意进入培养室，保证培养室清洁，以防对试验材料造成污染。

2 褐化问题

组织培养过程中，核桃等木本植物的外植体褐变比较明显。接种后的外植体和培养基均会褐变，褐化会抑制外植体的生长甚至死亡。一般可通过选择适宜外植体、添加褐变抑制剂及吸附剂、外植体预处理、选择最佳培养基和培养条件来解决。

2.1 选择适宜的外植体 木本植物组织培养的首选材料是幼嫩新生的外植体，如腋生枝上的顶芽，因其分生能力较强，比其他部位顶芽的褐变率低。

2.2 添加褐变抑制剂和吸附剂 由于褐化是由多酚物质氧化造成，可以通过在培养基中添加抑制剂，抑制外植体褐化。常用硫代硫酸钠（Na2S2O3）和抗坏血酸（VC），添加到培养基中可在一定程度上抑制外植体褐化，结合聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭等吸附剂的添加，可吸附褐化过程中产生的氧化产物，进一步减免对外植体的伤害。

2.3 外植体的预处理 对于易褐变的外植体材料进行预处理，可以减轻醌类物质对培养物的毒害作用。将易褐化的外植体放置在5 ℃左右的冰箱中低温处理12～24 h，再将外植体消毒后接种到只含有蔗糖和琼脂的培养基中，使褐化物质吸附到培养基中，再更换培养基，直至无明显褐化。

2.4 选择适宜的培养基和培养条件 因无机盐和激素水平可影响褐变发生，所以应提前通过反复试验来筛选降低褐化的最佳培养基。因强光会提高多酚氧化酶（PPO）活性，促进多酚类物质氧化，所以刚刚接种的外植体应在黑暗或弱光下进行初期培养。总之，选择适宜的培养基和培养条件均可降低褐化率。

3 结语

由于受到林业和树木本身生物学特性的限制，植物组织培养在林木树种中的研究稍滞后于生物学科的其他领域。通过组织培养能达到实用目的树种仍仅局限于桉、杨等少数树种，很多树种的组织培养存在污染率高、褐化难以控制、增殖系数低、难以生根等问题。

该文从试验中总结了一些林木树种中常见问题和解决对策。针对污染问题，可以选择幼嫩当年萌发的外植体，严格把关操作细节，严格控制外植体的培养环境。针对褐化问题，可选择适宜的培养基和激素浓度来抑制褐化，在培养基中添加抗褐化抑制剂与吸附剂，加大培养基的更换频率，可一定程度地减少褐化给外植体带来的危害。

组织培养技术在林木树中的应用还有很多技术难题亟待解决，尤其是针叶树的组织培养，这些问题的研究有待深入研究，使组培技术更加成熟和完善，能够得到更加广泛的应用，产生更大的生态效益、社会效益和经济效益。

[1]张小红，代侃韧，马兆平，等.核桃离体培养中外植体褐化的研究[J].陕西林业科技，2005（4）：7-9.

[2]张建成，张晓伟.核桃试管苗生根培养的研究[J].河北林果研究，2005（4）：361-365.

[3]张俊林，刘庆忠，刘松，等.核桃茎尖培养中防止褐变的方法[J].北京农学院学报，2007（2）：17-19.