常 超，王 凌，伍金娥,*

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.武汉轻工大学 大宗粮油精深加工省部共建教育部重点实验室，农产品加工与转化湖北省重点实验室，湖北 武汉 430023）

近年来，乳品安全成为人们关注的焦点，除了化学源污染以外，微生物超标也备受关注。乳品在整个生产过程中都受到微生物污染的威胁，对乳品生产过程中实施微生物在线监测是保障乳品安全的重要手段。目前检测乳品微生物的方法主要有传统的培养方法[1-2]、聚合酶链式反应（polymerase chain reactions，PCR）[3]、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[4]等，这些方法虽然准确，但具有耗时、不易在线监测和在基层推广使用等缺点，研发乳品微生物快速检测方法显得尤为迫切。

三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生物发光法是一种快速、便捷、易于操作的方法，整个检测过程仅为数分钟，其原理是将细菌内的ATP以自由的可溶解的状态释放出来，在有荧光素酶、镁、氧气存在条件下与虫荧光素发生反应产生荧光，通过荧光信号的强弱计算出测出ATP的含量，即可推算出样品中的含菌量[5-8]，反应过程见图1主反应。传统的ATP生物发光目前成功用于检测细菌[9-13]、酵母[14]以及其他真菌[15-17]，并且与平板计数法具有良好的相关性[18]，但是灵敏度不高，仅能检测细菌数103～104CFU/mL[19-20]，制约了该技术的应用。国内外的研究人员仍在不断尝试通过多种方式降低该方法的检测限，其中建立ATP再生系统以提高反应体系中的荧光信号值，是一种非常有效的解决方法[21-27]。所谓ATP再生系统是指利用生物发光主反应产物焦磷酸（pyrophosphoric acid，PPi）和一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）为原料，加入相应的底物和酶系，使得PPi或AMP再生成ATP，增强反应体系的荧光信号，提高方法的灵敏度，两条再生路线见图1[25]。现有的文献报道大多选择两条路线同时再生以提高方法的灵敏度，但是这样使得反应体系中酶系较多，酶促反应相互干扰，造成测定结果不稳定，重复性差，实际运用多用于在环境、水质监测[28-33]，很少有食品基质的报道，并且已报道的生物发光法大多建立的是以ATP标准品为检测对象的标准曲线，较少建立以菌液为检测对象的工作曲线，以ATP标准品为检测对象的标准曲线存在结果偏大的问题。此外，据文献报道PPi再生ATP途径转化效率高，是ATP再生优选的途径[26]。因此，本研究选择路线1再生ATP途径（图1虚线），利用ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase，ATPS）/腺苷酰硫酸（adenosine phosphosulfate，APS）系统实现ATP再生，偶联传统的生物发光法，减少试剂的使用，简化操作，优化各反应条件，建立混合菌液工作曲线，改进乳品基质前处理程序，评价方法的灵敏度、准确度、精密度和稳定性，实现对乳品中微生物灵敏快速检测，具有一定创新性和重要的经济价值。

图1 ATP再生途径Fig. 1 Recycling pathways for ATP amplification system

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜奶、奶粉 武汉中百超市；萤火虫荧光素酶、D-虫荧光素 美国Promega公司；APS、ATPS、ATP水解酶、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、ATP标准品 美国Sigma公司；其他试剂均为国产AR级；大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）由武汉轻工大学教育部大宗粮油精深加工省部共建重点实验室保藏。

1.2 仪器与设备

BHP9505-03型ATP快速检测仪 北京滨松光子技术股份有限公司；Milli-Q超纯水器 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 生物发光主反应条件的确定

参考本实验室前期研究结果[34]，生物发光主反应条件为D-荧光素质量浓度70 mg/L、萤火虫荧光素酶质量浓度50 mg/L、Mg2＋浓度0.25 mmol/L、Tris浓度25 mmol/L、BSA质量浓度0.5 mg/L、反应时间15 s、反应温度室温（25～30 ℃）。

1.3.2 PPi再生ATP循环条件的确定

采用单因素试验优化PPi再生ATP反应条件。固定ATPS活力（0.2 U/mL），加入不同浓度的APS（0～50 µmol/L）和10-11mol/mL PPi（相当于107CFU/mL），观察不同浓度APS对荧光信号的影响，确定最佳APS浓度。同理，考察不同ATPS活力（0～0.2 U/mL）、pH（7.5～8）对ATP再生的影响，确定最佳ATPS活力、最佳反应pH值。

1.3.3 工作曲线的建立

在最优的PPi再生ATP条件下偶联生物发光主反应建立混合菌液工作曲线。将大肠杆菌和铜绿假单胞菌配制成102～107CFU/mL混合菌液（浓度比1∶1），利用ATP再生系统结合的生物发光法检测其相对发光强度（relative luminescence，RLU），以菌液浓度的对数值（lg（CFU/mL））为横坐标，lg（RLU）为纵坐标，绘制工作曲线。

1.3.4 最低检测能力的确定

用系列浓度的ATP标准品（10-18～10-14mol/mL）、大肠杆菌（10～105CFU/mL）、铜绿假单胞菌（10～105CFU/mL）评价偶联方法的最低检测限，同时与传统的ATP生物发光法进行对比，考察偶联方法的灵敏度。

1.3.5 准确度、精密度、稳定性的测定

选择无菌水样、鲜奶、奶粉3 种基质，添加3 个水平的大肠杆菌，测定回收率，评价方法的准确度和精密度。测定103CFU/mL和105CFU/mL的大肠杆菌各10 次，评价方法的重复性及稳定性。

1.3.6 与传统方法的比较

制备20 个鲜奶样品，采用偶联方法和平板计数方法测定同一个样品，考察两种方法的相关性。平板计数操作参考GB/T 4789.2—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》[35]。

1.3.7 测定程序及样品前处理

1.3.7.1 方法测定简要程序

测定前向无菌测试杯中依次加入25 mmol/L Tris、0.5 mg/L BSA、0.25 mmol/L Mg2＋、10 µmol/L APS、0.15 U/mL ATPS、70 mg/L D-荧光素、50 mg/L萤火虫荧光素酶，无菌加样器吸取10 μL ATP提取液或ATP标准溶液于反应体系中，反应体系pH 7.8，反应15 s检测发光值。

1.3.7.2 改进样品前处理程序

奶粉用无菌水5 倍稀释，鲜奶和水样无需稀释，取待测样品加入等体积的0.4% Triton X-100溶液，再加入0.15 U/mL ATP水解酶水解5 min，95 ℃加热时间10 min，上机检测。

2 结果与分析

2.1 ATP再生循环条件

图2 APS浓度（A）、ATPS活力（B）、pH值（C）对PPi再生ATP再生循环的影响Fig. 2 Effects of APS concentration (A), ATPS activity (B) and pH (C) on ATP generation from PPi

如图2A所示，当APS浓度超过10 µmol/L，RLU趋于平稳，故APS最佳浓度为10 µmol/L。如图2B所示，当ATPS活力超过0.15 U/mL，RLU趋于平稳，故最佳ATPS活力为0.15 U/mL。如图2C所示，当pH值增加到7.8时，反应体系的RLU达到峰值，故pH值选择7.8。

2.2 工作曲线

在最佳ATP再生条件下偶联生物发光法，以菌液浓度的对数值（lg （CFU/mL）） 为横坐标、lg（RLU）为纵坐标，建立大肠杆菌和铜绿假单胞菌混合菌液（浓度比1∶1）工作曲线，曲线在102～107CFU/mL范围内，线性关系好，回归方程y=0.72x＋0.29，R=0.984。

2.3 最低检测限

图3 ATP再生与非再生体系最低检测限Fig. 3 Lowest detection limits in ATP amplification system and ATP nonamplification system

分别用系列浓度的ATP标准品（10-18～10-14mol/mL）、大肠杆菌（10～105CFU/mL）、铜绿假单胞菌（10～105CFU/mL）在ATP再生和非再生检测体系中进行灵敏度对比实验，考察ATP标准品、大肠杆菌、铜绿假单胞菌在两种检测体系中的检测限。如图3所示，传统ATP生物发光法即ATP非再生检测体系对ATP标准品、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的检测限分别为10-16mol/mL、103CFU/mL和103CFU/mL，但偶联ATP再生反应后，表现更低的检测限，灵敏度下降了一个数量级，分别为10-17mol/mL、102CFU/mL和102CFU/mL，低于现有文献报道的103CFU/mL[12-13]。我国最新国家乳品标准GB 19644—2010《乳粉》规定乳粉微生物标准5×105CFU/mL，原料奶微生物标准105CFU/mL，本方法线性范围为102～107CFU/mL，对菌液的检测限为102CFU/mL，因此能够更灵敏地完成对乳品微生物检测。

2.4 回收率及变异系数

表1 回收率及变异系数（n=5）Table1 Recoveries and coefficients of variation of E. coli in spiked samples (n= 5)

快速、易于在线监测乳品微生物动态变化等优势，是检测乳品微生物一种可靠的替代方法。

图5 鲜奶样品中ATP再生生物发光法与平板计数法的相关性Fig. 5 Correlation between the presented method and the plate count method for fresh milk

3 讨 论

如表1所示，3 种基质中回收率为81.33%～97.78%，变异系数为14.24%～22.17%，除了个别组变异系数超过20%，这与微生物在实验操作过程中较化学物质具有不稳定性有关，其他均小于20%，达到检测方法对回收率和变异系数的要求。乳品基质与水样结果比较可知，乳品基质对样品的测定干扰较小，表明本实验改进的样品前处理方法可行。

2.5 稳定性实验结果

测定103CFU/mL和105CFU/mL的大肠杆菌各10 次，评价方法的重复性及稳定性。图4显示在103、105CFU/mL两个浓度下，其荧光值在均值上下波动，波动范围较小，重复性好，测定结果稳定。

图4 方法的稳定性Fig. 4 Stability analysis of the method for detection of E. coli at concentrations of 103 and 105 CFU/mL

2.6 方法的考察结果

采用偶联方法测定人为制备未知浓度的20 个鲜奶样品，同时进行平板计数，比较与国标方法的相关性。如图5所示，两种方法检测具有良好的相关性（R=0.96），表明本方法测定结果可靠，较国标方法具有操作简单、

乳品微生物监测是控制乳品质量安全的重要技术手段之一，但目前实际应用的多为培养方法[1-2]、PCR[3]、ELISA[4]等，这些方法存在检测结果滞后等问题。ATP再生循环系统偶联生物发光法具有快速、准确等优势，适用于在线监测和在基层推广使用。本研究表明，ATP再生循环系统偶联生物发光法对ATP标准品、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的检测限分别为10-17mol/mL、102CFU/mL和102CFU/mL，对乳品基质的回收率为81.33%～97.78%，变异系数为14.24%～22.17%，与国标平板计数法具有良好的相关性。本方法是一种灵敏、准确、简单的检测方法。

方法学转化成试剂盒是检测方法能否实际运用的关键一步，由于本研究体系中应用酶系较多，酶的稳定性以及酶的保护剂对方法学指标的影响有待进一步研究。

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