肺炎克雷伯菌携带碳青霉烯酶KPC-2的基因环境的多态性研究

沈平华，仉英，蒋晓飞

摘要：目的：KPC（Klebsiella pneumoniaecarbapenemases）是导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的主要原因，而KPC-2是KPC中最常见的类型之一。中国地区已经报道的关于KPC-2的耐药基因分别位于肺炎克雷伯菌中的pKP048和pKPHS2质粒上，通过对质粒全基因测序发现了两种携带blaKPC-2的基因环境：pKP048（GenBank accession no：FJ628167.2）的耐药基因位于一个完整的Tn1721样转座子中；pKPHS2（GenBank accession no：CP003224.1）上的基因环境为Tn1721-blaKPC-2-△Tn3-IS26样的新结构，即Tn1721结构被IS26在Tn3的tnpR处打断，造成tnpATn3和IRL2Tn1721的丢失。blaKPC-2的基因环境是了解blaKPC-2播散途径的重要信息，是进行有效的院感控制的基础。本研究将华山医院自第一株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌检出到该耐药细菌广泛播散的这段时期内耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌作为一个完整的样本，运用PCR及测序获得携带blaKPC-2的完整的基因结构及侧翼序列，希望为下一步深入研究该耐药基因的播散机制提供全面的基因背景。方法：收集华山医院自2006年8月—2009年12月连续不重复的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，共42株。运用引物KPC-FOR：5'-TCGCTAAACTCGAACAGG-3'和KPCREV：5'-TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC-3'，以抽提的质粒为模板，对42株细菌进行blaKPC-2筛选。随后进行多位点序列分型（MLST）。根据pKP048和pKPHS2的序列，设计了一系列PCR引物进行扩增与测序，分别用于检测本批菌株中是否存在与上述已经报道的blaKPC-2的基因环境相同的结构。结合后续的crossing PCR可以覆盖整个基因环境的序列。PCR阳性产物送上海迈浦生物科技有限公司纯化后测序。根据Junction PCR与Mapping PCR的结果，当出现区别与以上两种结构的新结构时，拟运用代表性质粒测序及以纯质粒为模板进行PCR walking等方法，获得整个新结构的完整基因环境的序列。……