张琦，帅训军，侯念果，艾登斌*

（1泰山医学院研究生院临床麻醉学教研室，泰安，271000；2山东省青岛市市立医院麻醉科，山东省青岛市临床麻醉研究中心，青岛，266000）

近年来临床危重病如烧伤、创伤、感染、败血症、肺炎、误吸胃内容物、毒性物质摄入、胰腺炎、出血性休克等发病率不断提高，患者全身炎症反应细胞介导弥漫性肺损害，并发急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征（acute lung injury / acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS），严重危害患者健康。ALI/ARDS的急性期病理表现为急剧弥漫性大量中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞聚集、浸润肺泡组织，导致肺泡毛细血管内皮、肺泡上皮通透性增加，血液中细胞、蛋白质等流体成分渗入间质间隙、肺泡腔，肺组织顺应性持续降低，引起非心源性肺水肿[1]。患者临床表现为难治性低氧血症和致命性呼吸衰竭[2]。目前大多采取保护性肺通气、保护性液体治疗、细胞因子和内毒素拮抗剂、血滤以及抗生素等对症治疗策略缓解患者急性期的临床症状，无法从根本上实现结构重建、恢复正常的气体交换。这不仅增加患者的经济负担，也给社会造成巨大压力[3]。免疫原性极低的干细胞，因其对ALI/ARDS的“拯救”作用逐渐引起学者重视，现主要针对干细胞如何在ALI/ARDS治疗过程中所发挥作用及其机制进行综述。

1 间充质干细胞的生物学定义

由于迄今为止尚未发现间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）特异性的表面标志物，因此2006年国际细胞治疗协会通过了沿用至今的3个标准，赋予MSC准确的定义：①在标准的组织培养条件下，MSC必须贴壁生长；② MSC细胞表面必须表达CD105、CD90和CD73等标志物，但不能够表达CD45、CD34、CD14和CD11b；③在体外培养条件下，MSC必须具有分化为间充质细胞谱系的能力，包括成骨细胞、脂肪细胞和成神经细胞[4]。鉴于实验技术的不断提高，目前已从多种组织中成功分离出MSC，主要包括脐带血、胎盘、脂肪和肺组织。研究表明，MSC不具备胚胎干细胞的可塑性，仅能分化为成纤维细胞、肌成纤维细胞、成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和上皮细胞[5]等细胞谱系。由于MSC免疫原型极低，易分离、培养，临床使用过程中并不涉及类似于胚胎干细胞常常引起的伦理问题，因此过去几年围绕干细胞展开大量研究，MSC在人类成骨不全、骨关节炎、移植物抗宿主病、克罗恩氏病、慢性阻塞性肺疾病、急性心肌梗塞、糖尿病、缺血性心力衰竭、肝功能衰竭以及急性肾功能衰竭等疾病具有潜在的治疗作用[6]。有趣的是，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的ALI/ARDS动物静脉注射MSC后，其优先归巢于受损严重的肺组织，与在肺组织正常的阴性对照组相比，MSC在ALI/ARDS动物肺组织存活时间明显延长。

2 间充质干细胞治疗急性肺损伤的机制

来源于肺内、外的干/祖细胞群可以在呼吸道各个部位再生出肺泡上皮和血管内皮细胞，通过旁分泌或内分泌方式释放：①可溶性生长因子，促进肺泡上皮细胞生长；②抗炎细胞因子抑制炎症反应，抗菌、抗微生物肽等细胞成分直接杀灭肺组织局部的细菌；③调节先天性和适应性免疫的细胞因子、调节肺泡上皮和肺内皮细胞通透性的细胞因子，在ALI/ARDS的治疗中发挥其强大的作用。

2.1 微泡的生物学功能

MSC腹腔内给药减轻了LPS诱导的肺部炎症反应，而仅有不足1%的MSC定植于肺组织，说明其抗炎作用并非依赖于其局限性的定位于肺组织，而主要通过释放旁分泌可溶性因子来介导[7]。Wang及其同事经实验得出结论：移植到ALI小鼠肺部的MSC，可恢复肺内皮细胞通透性、清除肺泡腔渗出液，同时发挥抗感染作用[8]。已知经氧糖剥夺，可以刺激MSC释放跟细胞本身一样具有生物活性、直径50～200nm之间的无核质膜结合片段，这些片段即为微泡（microvesicle, MV）。MV作为外泌体，从多种细胞类型的胞质隔室内组成性释放或者直接从质膜上脱落。与干细胞类似，微泡主动性归巢于肺组织炎症部位。肺泡上皮细胞通过CD44受体介导的摄取作用将MV内化，MV将其装载的具有修复损伤和抗炎特性的蛋白质、多肽、mRNA、microRNA、脂质和线粒体等细胞器转移至受损上皮细胞内行使功能[9]，事实上MSC分泌的MV在受损肺组织发挥与MSC相同的治疗作用。Camussi及其同事通过实验得出：MV将mRNA和microRNA转移至受损肾小管上皮细胞介导保护作用，减少受损的肾小管上皮细胞凋亡[10]。

2.2 角质形成细胞生长因子的生物学作用

对MV内mRNA进行RT-PCR实验分析显示，角质形成细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）的mRNA含量丰富。KGF siRNA预处理MSC，其释放的MV治疗效果下降，表明KGF蛋白表达在MV的治疗机制中作用重大[11]。KGF是一种强有效的上皮组织特异性促分裂原和分化因子。KGF提高II型肺泡上皮细胞有丝分裂活性，刺激细胞增值、分化以及DNA修复，提高肺泡上皮脂质、蛋白质和肺泡表面活性剂的分泌、钠和氯转运蛋白的转录和翻译，抑制受损肺泡上皮以及内皮细胞凋亡。

KGF是负责维持内皮屏障稳态的关键介质，Lee及其同事发现提高人MSC（hMSC）分泌KGF的功能，有助于受损肺泡内的液体清除[12]。KGF通过FGF-2络氨酸激酶受体（FGFR2-IIIb）作用于肺泡上皮细胞，增加肺泡上皮细胞钠离子通道、血管生成素-1和钠-钾-ATP酶的活性及肺泡内液体转运能力，减轻ALI/ARDS导致的肺水肿[13]。Aguilar等人发现用四环素诱导KGF构建体转染MSC后，保护博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的肺功能。Le将重组的DN23-KGF经气管内滴注实验动物，增强血管内皮生长因子和TGF-β的生成，提高肺组织再生修复[14]功能。Tong及其同事发现KGF-2通过PI3K和P42/44 MAP激酶途径诱导ATII增值[15]。通过Poly(I:C)处理的MV进一步增加KGF的分泌，提高MV降低LPS诱导小鼠ALI的支气管肺泡灌洗液中的细菌计数的作用[16]。Wu在小鼠肺炎模型中，KGF刺激肺泡上皮细胞分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），增加巨噬细胞向肺泡区域的募集性，启动STAT5磷酸化，激活并增强肺泡巨噬细胞对革兰氏阴性菌的吞噬活性、氧化剂反应和灭菌作用。KGF还以剂量依赖性方式增加AKT磷酸化，降低血液单核细胞的乳酸脱氢酶（LDH）释放量，综上，KGF在抗肺泡上皮细胞凋亡的同时还增加细菌的清除率[17]。

2.3 肝细胞生长因子的生物学作用

经过低氧培养和LPS刺激放大MSC旁分泌HGF的作用，提高其改善肺微血管内皮细胞的通透性、降低免疫细胞从血液到肺间质和肺泡的浸润程度[18]的效果。HGF诱导血管内皮细胞增殖、促血管生成，抑制Rho GTPase以提高肺内皮细胞稳定性、完整性，抑制细胞凋亡。HGF改善肺微血管内皮细胞（HMVEc）的蛋白质通透性，修复细胞间紧密连接和内皮细胞的连接点，还原细胞骨架[19]。HGF降低TNF-α、IL-6和细胞间黏附分子-1的分泌和表达。HGF增加抗炎细胞因子IL-10、Bcl-2的表达，抑制Caspase 3的激活来提高MSCs在肺组织的存活率[20]。通过实验证实HGF降低转化生长因子b、Colla1（1型胶原，a1）等导致组织纤维化的细胞因子的表达，抑制纤维化的进展和凝血酶损伤后的肺内皮细胞中肌动蛋白应力纤维的形成[21]，改善高氧诱导的氧化应激、放射性损伤啮齿动物模型中肺、支气管等结构的异常发育[22]。HGF激活SPK后释放磷酸肌醇3-激酶、启动EPK/MAPK途径，产生生物活性脂质SIP并激活其下游信号。Wang研究发现MSC-HGF增加SIPR1在肺中的表达，而SIP1在血管生成、血管成熟以及免疫调节细胞的运输、内皮屏障功能、维持血管壁张力等方面起关键作用[23]。SIP/ SIPR1参与HGF/cMet介导的抗炎和抗纤维化反应，通过基因治疗改善放射性肺损伤导致的肺部炎症因子浸润、减少促纤维化因子的分泌，抑制肺纤维化。基因修饰后过表达HGF的MSC可以预防博来霉素诱导的肺纤维化、高原性肺水肿、LPS、机械通气或者缺血再灌注诱导的肺损伤，有望提供治疗心脏、肝脏、肠和肺等损伤的新手段。值得注意的是，KGF只在肺组织受伤之前或者受伤同时使用才有效。

2.4 血管生成素-1的生物学作用

MSC还分泌大量Ang-1，参与恢复肺泡上皮完整性、稳定血管、抗炎、抗渗透。Ang-1的本质是配体络氨酸激酶Tie2的受体，Tie2调控内皮细胞迁移、促进血管形成、稳定新形成的血管。Tie蛋白存在于成人静止的上皮细胞内，Ang-1与Tie2结合后迅速介导受体磷酸化，参与维持细胞静息和存活状态[24]。研究证实，Ang-1在胚胎血管发育中起重要作用，在个体出生后，Ang-1负责稳定静息血管表型，因而也被称为内皮存活和血管稳定因子。通过修饰内皮细胞黏附分子的表达和细胞间连接来降低内皮细胞通透性，抑制白细胞-内皮细胞相互作用[25]。

肺泡上皮由90% ATI和10%ATII组成，ATII合成表面活性蛋白、转运钠和氯离子，清除肺泡内液体。正常情况下肺泡上皮细胞间单层细胞连接比内皮细胞的连接更紧密，ATI、ATII之间的细胞骨架的主要为紧密连接、粘附连接和桥粒组成细胞连接复合物，形成物理屏障，限制蛋白质、脂质扩散，维持肺泡上皮的屏障特性[26]。而上皮屏障功能障碍直接引起富含蛋白质的水肿液、炎症细胞在肺泡聚集。Ang-1提高肌动蛋白等细胞骨架的重建，恢复ATII的通透性。

2.5 线粒体的生物学作用

线粒体是细胞发生氧化磷酸化的能量工厂，参与细胞间、细胞内的信息传递的同时，为细胞新陈代谢提供能量。通过减轻细胞内的钙超载，稳定线粒体膜电位可以提高线粒体的活性，改善ATP酶和线粒体呼吸链酶复合体活性。线粒体是氧自由基（ROS）的产生场所，功能受损后将释放大量具有杀伤力的氧自由基，导致细胞凋亡。研究表明，ALI/ARDS炎症反应的早期阶段即出现显著的线粒体功能失调、结构改变，产生大量氧自由基（ROS），导致生物膜脂质、蛋白质、DNA发生过氧化，最终启动细胞凋亡通路，造成组织严重损伤。Wang及其同事通过光学显微技术发现LPS诱导ALI小鼠的线粒体，从MSC转移至肺上皮细胞[23]，与LPS感染后滴注MSC相比，在LPS感染之前滴注MSC提高了受损肺组织再生率、肺部保护剂的分泌量以及受损上皮细胞内抗氧化剂如SOD、GPX、CAT和GR的正常活性和分泌计量。

Vallabhaneni[27]及其同事发现，MSC在体外与肺泡上皮细胞通过交换肌动蛋白微粒从而形成由Cx43组成的隧道纳米管（TNT），同时MSC细胞内也形成TNT以运送包裹线粒体的微泡（MV）。MV不仅先于TNT之前形成，而且参与TNT的形成过程[28]。Islam[29]及其同事发现，向LPS损伤后的小鼠气管内滴注BMSC，其更倾向于归巢于高表达Cx43的肺泡上皮细胞区域。钙离子作为启动信号启动BMSC形成装载线粒体的MV，MV参与形成TNT并向上皮细胞转运。Ahmad[30]及其同事发现一种钙敏感衔接蛋白Miro1，其本质是线粒体Rho-GTPase,Miro1通过Miro2、TRAK1、TRAK2等一系列辅助蛋白，将线粒体附着于KIF5运动蛋白和Myo19，加速其从MSC向上皮细胞（EC）移动。Chang[31]发现Miro1提高线粒体摄取钙离子的速度，高浓度钙离子加速线粒体沿细胞内及细胞间纳米微管（TNT）移动。通过光学实验只观察到线粒体从MSC转移至肺泡上皮细胞（EC），至今尚未发现线粒体的逆转运，表明线粒体的转移具有方向性。线粒体转运至EC为细胞新陈代谢提供能量，降低受损细胞内活性氧含量，阻止细胞凋亡。

3 问题与展望

诱导实验动物的ALI/ARDS模型不能完全复制人类患者临床ALI/ ARDS的复杂性。尽管目前尚未在动物实验中发现致命的免疫排斥反应，动物实验向临床试验过渡还存在不可预测的安全隐患。由于对MSC的认识尚存在着局限性，拥有强大的自我更新以及多向分化潜能的MSC归巢于受损肺泡上皮细胞后，发挥调节免疫、抗炎以及抗纤维化作用所涉及的分子机制和信号途径仍不明确[32]，除此之外仍需对其安全性、最佳治疗时间窗、最适治疗剂浓度及剂量进行深入研究，同时干细胞分离、培养技术有待规范和提高。综上所述，我们寄希望于MSC为ALI/ARDS的治疗带来全新的应用前景和曙光的同时，也相应面临了一系列需要我们克服的现实困难。面对这些新的挑战，任然需要继续开展更多的临床试验，广大研究者仍需刻苦钻研以取得新突破。

[1] Hu S, Li J, Xu X, et al. The hepatocyte growth factor-expressing character is required for mesenchymal stem cells to protect the lung injured by lipopolysaccharide in vivo. Stem Cell Res Ther, 2016, 7(1): 66.

[2] Zhang S, Danchuk SD, Imhof KM, et al. Comparison of the therapeutic effects of human and mouse adipose-derived stem cells in a murine model of lip opolysaccharide-induced acute lung injury. Stem Cell Res Ther, 2013, 4(1): 13.

[3] Bruno S, Grange C, Collino F, et al. Microvesicles derived from mesenchymal stem cells enhance survival in a lethal model of acute kidney injury. PLoS One, 2012, 7(3):e33115.

[4] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006, 8(4): 315-317.

[5] Matthay MA, Thompson BT, Read EJ, et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for severe acute lung injury. Chest, 2010, 138(4): 965-972.

[6] Lee RH, Pulin AA, Seo MJ, et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-in fl ammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell, 2009, 5(1): 54-63.

[7] Danchuk S, Ylostalo JH, Hossain F, et al. Human multipotent stromal cells attenuate lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice via secretion of tumor necrosis factor-α-induced protein 6. Stem Cell Res Ther, 2011, 2(3):27.

[8] Wang YY, Li XZ, Wang LB, et al. Therapeutic implications of mesenchymal stem cells in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Stem Cell Res Ther, 2013, 4(3): 45.

[9] Ratajczak MZ. The emerging role of microvesicles in cellular therapies for organ/tissue regeneration. Nephrol Dial Transplant, 2011, 26(5): 1453-1456.

[10] Camussi G, Deregibus MC, Cantaluppi V, et al. Role of stem-cell-derived microvesicles in the paracrine action of stem cells. Biochem Soc Trans, 2013, 41(1): 283-287.

[11] Zhu YG, Feng XM, Abbott J, et al. Human mesenchymal stem cell microvesicles for treatment of Escherichiacoli endotoxin-induced acute lung injury in mice. Stem Cells, 2014, 32(1): 116-125.

[12] Lee JW, Fang X, Gupta N, et al. Allogeneic human mesenchymal stem cells for treatment of E. coli endotoxin-induced acute lung injury in the ex vivo perfused human lung. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(38): 16357-16362.

[13] Sartori C, Matthay MA. Alveolar epithelial fluid transport in acute lung injury: new insights. Eur Respir J, 2002, 20(5): 1299–1313.

[14] Le Blanc K, Tammik C, Rosendahl K, et al. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol, 2003, 31(3): 890-896.

[15] Portnoy J, Curran-Everett D, Mason RJ, et al. Keratinocyte growth factor stimulates alveolar type II cell proliferation through the extracellular signal-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-OH kinase pathways. Am J Respir Cell Mol Biol, 2004, 30(6): 901-907.

[16] Monsel A, Zhu YG, Gennai S, et al. Therapeutic Effects of Human Mesenchymal Stem Cell-derived Microvesicles in Severe Pneumonia in Mice. Am J Respir Crit Care Med, 2015, 192(3): 324-336.

[17] Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell reponses.Blood, 2005, 105(4):1815–1822.

[18] Chen QH, Liu AR, Qio HB, et al. Interaction between mesenchymal stem cells and endothelial cells restores endothelial permeability via paracrine hepatocyte growth factor in vitro. Stem Cell Res Ther, 2015, 6(1): 44.

[19] Higginbotham K, Tian Y, Gawlak G, et al. Hepatocyte growth factor triggers distinct mechanisms of Asef and Tiam1 activation to induce endothelial barrier enhancement. Cell Signal, 2014, 26(11): 2306-2316.

[20] Chen S, Chen X, Wu X, et al. Hepatocyte growth factor-modified mesenchymal stem cells improve ischemia/reperfusion-induced acute lung injury in rats. Gene Ther, 2017, 24(1): 3-11.

[21] Birukova AA, Alekseeva E, Mikaelyan A, et al. HGF attenuates thrombin-induced endothelial permeability by Tiam1-mediated activation of the Rac pathway and by Tiam1/Rac-dependent inhibition of the Rho pathway. FASEB J, 2007, 21(11): 2776-2786.

[22] Aslam M, Baveja R, Liang OD, et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am J Respir Crit Care Med, 2009, 180(11): 1122-1130.

[23] Hua W, Yang YF, Zhao L, et al. Hepatocyte Growth Factor Gene-Modi fi ed Mesenchymal Stem Cells Reduce Radiation-Induced Lung Injury. Hum Gene Ther, 2013, 24(3): 343-353.

[24] Fang X, Neyrinck AP, Matthay MA, et al. Allogeneic human mesenchymal stem cells restore epithelial proteinpermeability in cultured human alveolar type II cells by secretion of angiopoietin-1. J Biol Chem, 2010, 285(34): 26211-26222.

[25] Gamble JR, Drew J, Trezise L, et al. Angiopoietin-1 is an antipermeability and anti-in fl ammatory agent in vitro and targets cell junctions. Circ Res, 2000, 87(7): 603-607.

[26] Harhaj NS, Antonetti DA. Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(7): 1206-1237.

[27] Vallabhaneni KC, Haller H, Dumler I, et al. Vascular Smooth Muscle Cells Initiate Proliferation of Mesenchymal Stem Cells by Mitochondrial Transfer via Tunneling Nanotubes. Stem Cells Dev, 2012, 21(17): 3104-3113.

[28] Liu K, Ji K, Guo L, et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia–reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res, 2014, 92: 10-18.

[29] Islam MN, Das SR, Emin MT, et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med, 2012, 18(5): 759-765.

[30] Ahmad T, Mukherjee S, Pattnaik B, et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. EMBO J, 2014, 33(9): 994-1010.

[31] Chang KT, Niescier RF, Min KT, et al. Mitochondrial matrix Ca2+ as an intrinsic signal regulating mitochondrial motility in axons. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(37): 15456-15461.

[32] Wecth S, Rojas M. Mesenchymal stem cells in the treatment of chronic lung disease. Respirology, 2016, 21(8): 1366-1375.