唐曦，胡娅，徐炎华，汪春林，邱萍，王向辉

（1.华中科技大学同济医学院附属荆州医院 肿瘤中心，荆州 湖北 434020；2.长江大学医学院，荆州 湖北 434023；3.华中科技大学同济医学院附属荆州医院 胸外科，荆州 湖北 434020）

肺癌的发病率居全世界所有恶性肿瘤的首位，年全球新增病例高达180万，肺癌也是死亡率最高的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤死亡的30%左右[1]。近年来，肺腺癌在所有肺癌中所占的比例也逐步提高。目前应用于临床的肺腺疾病诊断方法有多种，但真正较为成熟或有理想应用前景的诊断肺腺癌的手段并不多。

MicroRNA是一类内源性的非编码RNA，由19～25个左右核苷酸组成，通过与靶mRNA的3’-UTR碱基互补配对，从而抑制mRNA翻译或直接使其降解，导致靶基因的表达在转录后水平受到抑制，最终调控基因表达[2]。近年来的研究表明血清miRNAs表达谱与肿瘤的病理及临 床特征都有关系，并且可以预测肿瘤的预后和指导临床的处理。很多miRNAs在肺腺癌患者血清或癌组织中的异常表达可以影响肿瘤的行为和进展，其中包括miR-498、miR-21、miR-137、miR-206、miR-138、miR-32、miR-125b[3-8]。LI等[5]的研究发现miR-32在肺腺癌组织中表达增加，并可以通过下调TWIST从而影响肺腺癌的进展。CHEN等[8]的研究结果显示miR-206靶向下调MET，抑制肺腺癌细胞的转分化。但是目前为止这7种miRNA在患者血清中的表达及其在肺腺癌诊断中的应用价值尚未有报道。

在本研究拟通过检测正常人群、肺腺癌患者血清 中 miR-498、miR-21、miR-137、miR-206、miR-138、miR-32、miR-125b这7种miRNA的表达情况，分析其在肺腺癌诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年4月-2016年4月华中科技大学同济医学院附属荆州医院肿瘤中心215例术前疑似肺癌患者及40例正常体检人群静脉血，血液采集后立即离心，血清保存于-80℃冰箱。所有患者术前均未行任何放、化疗。入选者年龄37～83岁，平均（63.7±6.9）岁。最终术后病理诊断确认肺腺癌患者59例。本研究中患者均签署知情同意书，并由华中科技大学同济医学院附属荆州医院伦理委员会审核通过。

1.2 方法

1.2.1 实验试剂RNA提取试剂（美国Invitrogen公司），TaKaRa逆转录试剂盒（大连宝生物公司），SYBR Green荧光染料试剂盒（Roche公司），PCR引物由上海吉玛公司设计合成。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测基因表达 提取所收集患者和体检人群血清中总RNA，将提取的RNA进行逆转录合成cDNA，反应体系为20μl，反应条件为：16℃ 30 min，45℃ 30 min，85℃ 5 min。运用SYBR Green法检测miR-498、miR-21、miR-137、miR-206、miR-138、miR-32 及 miR-125b的表达情况，运用的反应条件为：94℃ 15 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循环 40 次 ；最后72℃延伸8 min。每组样品重复3次，实验重复3次，分析各标本中miR-498、miR-21、miR-137、miR-206、miR-138、miR-32及miR-125b的表达。

1.3 统计学方法

采用Medcalc和GraphPad Prism6.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析，计数资料间比较用χ2检验，ROC曲线分析用于各miRNA对诊断肺腺癌的敏感性与特异性分析，采用多元Logistic回归分析进行miR-498、miR-21、miR-137 3者联合的ROC曲线分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌相关的miRNAs在两组患者中的表达情况

肺腺癌患者血清中miR-21、miR-137和miR-498表达量与正常体检人群比较，差异有统计学意义（P＜0.05），肺腺癌患者增加 ；miR-206、miR-138、miR-32、miR-125b的表达量两组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

表1 两组患者血清中7种miRNAs的比较 （±s）

表1 两组患者血清中7种miRNAs的比较 （±s）

组别 miR-498 miR-21 miR-137 miR-206 miR-138 miR-32 miR-125b正常体检人群（n =40） 2.12±0.74 3.58±1.35 6.43±2.39 0.35±0.03 0.38±0.13 7.84±1.39 1.44±0.15肺腺癌患者（n =59） 2.84±0.90 5.90±1.95 8.29±2.88 0.35±0.11 0.41±0.22 8.17±1.32 1.51±0.17 F值 17.45 42.27 11.39 1.79 1.57 1.21 0.46 P值 0.000 0.000 0.001 0.174 0.243 0.313 0.501

2.2 miR-498、miR-21及miR-137在肺腺癌诊断中的ROC曲线分析

为了进一步评价血清miRNAs在肺腺癌诊断中的应用，本研究继续对miR-498、miR-21及miR-137这3种两组间表达有差异的miRNA做了ROC曲线分析。结果显示miR-498的曲线下面积（area under curve，AUC）为0.73（95%CI，0.63～0.81），miR-21的 AUC为 0.83（95%CI，0.74～ 0.90），miR-137的AUC 为 0.74（95%CI，0.64 ～ 0.82）（见图 1～3）。根据ROC曲线分析，本研究进一步确定miR-498、miR-21及miR-137用于诊断肺腺癌的最佳cut-off值，以及其在肺腺癌诊断中的敏感性和特异性（见表2）。对3种血清miRNAs肺腺癌诊断中做ROC曲线对比，结果显示miR-498、miR-21及miR-137之间差异无统计学意义（P＞0.05）（见图 4）。

图1 miR-498的表达情况以及在肺腺癌诊断中的ROC曲线分析

图2 miR-21的表达情况以及在肺腺癌诊断中的ROC曲线分析

图3 miR-137的表达情况及在肺腺癌诊断中的ROC曲线分析

图4 miR-498、miR-21及miR-137在肺腺癌诊断中的ROC曲线分析比较

2.3 miR-498、miR-21及miR-137 3者联合在肺腺癌诊断中的ROC曲线分析

采用多元Logistic回归分析得出用miR-498、miR-21及miR-137 3者联合在肺腺癌诊断时其前的系数（miR-498、miR-21及miR-137）= -12.0668 +1.46085×miR-498+1.38797×miR-21+0.33292×miR-137。miR-498、miR-21及 miR-137 3者 联 合在肺腺癌诊断中的ROC分析结果见表3。miR-498、miR-21及miR-137的AUC值大于单一检测任一miRNA，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

表2 ROC曲线分析比较

表3 miR-498、miR-21及miR-137在肺腺癌诊断中的ROC曲线分析

图5 miR-498、miR-21及miR-137在肺腺癌诊断中的ROC曲线分析比较

3 讨论

M iRNAs是一类进化上高度保守的非编码小分子单链RNA，不仅可以游离于细胞之外，还能稳定的存在于血清中，研究表明血清miRNA耐RNA酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境及长期保存等各种处理方法均不会造成血清miRNAs的损失，其具备作为疾病分子生物标志物的许多优点[9-10]。虽然血清miRNAs的来源尚无定论，但是miRNAs在不同疾病及病理进程中具有特定的表达谱，已经在多种肿瘤、自身免疫性疾病及炎症等多种疾病的诊断和预后中显示了独特的价值。

本研究选取了目前在肺腺癌领域研究热门的7种miRNAs， 包 括 miR-498、miR-21、miR-137、miR-206、miR-138、miR-32及miR-125b，检测其在正常人群及肺腺癌患者血清中的表达情况，发现miR-498、miR-21及miR-137在肺腺癌患者血清中表达增加。MIMA等[11]的研究显示，相比于正常结肠组织，在结肠癌组织中，miR-21表达增加，并与结肠癌的浸润程度以及预后相关，之后他们进一步通过用miR-21干预结肠癌细胞，发现miR-21可以增加肿瘤细胞的增殖和侵袭[12]。同样的，LEITE等[13]的研究发现在前列腺癌细胞中，miR-21通过控制RECK通路，从而增加前列腺癌细胞中MMP-9的表达，增加肿瘤细胞的侵袭能力。与本实验的研究结果相符，JIANG等[7]的研究也发现肺腺癌患者血清中以及肺腺组织中miR-21的表达都升高，并在细胞实验中进一步证实miR-21可以靶向结合缺氧诱导因子α，不仅可以作为肺腺癌诊断及疗效评估的1个标志，而且还在肺腺癌的进展中发挥重要的调控作用。MiR-498是一种抑癌miRNAs，可调节多种与肺癌、结肠癌及宫颈癌等多种肿瘤的生长、侵袭和转移调节有关的抑癌基因或蛋白，从而调控多种肿瘤的发生发展[14-17]。最近，WANG及其团队的研究结果[14]发现miR-498在非肺小细胞肺癌中表达减少，而且miR-498的表达情况与肿瘤的侵袭程度呈负相关。

为了进一步评估miR-498、miR-21及miR-137在肺腺癌诊断中的临床应用价值，本研究进一步对这3种miRNAs做ROC曲线分析，发现血清miR-498、miR-21及miR-137的表达情况在肺腺癌诊断中具有较高的AUC值，分别为0.73、0.83及0.74。之后笔者采用多元Logistic回归分析得出用miR-498 & miR-21 & miR-137在肺腺癌诊断时其前的系数，对（miR-498 & miR-21 & miR-137）行ROC曲线分析发现其AUC值为0.93，优于单一使用任一miRNA来诊断肺腺癌。与笔者的研究结果相符，ZUO等[18]的研究发现在检测AFP的基础上，联合检测血清miR-125b和miR-27a的水平，可以大大提高早期肝癌患者诊断的敏感性和特异性。GU及其团队的研究[19]也发现联合检测血清miR-182、miR-200c及miR-221的水平可以提到前列腺癌的检出水平。随着现在检测技术和设备的提升，在少量的样本中快速、灵敏的对miR-498、miR-21和miR-137同时进行检测已成为可能[20]。miR-498、miR-21和miR-137联合检测可以大大提高肺腺癌诊断的敏感性和特异性，在肺腺癌的诊断中具有潜在的应用价值。

本研究存在不足之处，由于成本问题，本研究纳入的样本量相对较少，无法对大规模的样本进行初步筛选，将在后续的研究中针对miR-498、miR-21和miR-137，釆取前瞻性研究的方法，进一步验证其在肺腺癌诊断及预后中的价值。

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