杨文平+王爱民+於叶兵+刘飞+吕林兰+吕富

摘要：分离、克隆梭鱼脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，简称FAS）基因的部分cDNA片段（GenBank登录号为KJ848474），共920 bp，编码303个氨基酸，序列分析表明梭鱼FAS基因与其他物种的同源性为74%～95%，其中与军曹鱼、斑马拟丽鱼相似性达95%。FAS基因mRNA在梭鱼鱼皮、肌肉、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、胃、肠、腹腔脂肪、脑和鳃组织中表达丰度差异显著（P<0.05），脑中含量最高，其次是肝脏和腹腔脂肪组织，肌肉中表达量最低，其余7种组织中的表达量均显著低于脑和肝脏（P<0.05）。此外，还研究了饲料脂肪水平对梭鱼FAS活性和mRNA表达的影响，平均质量为（9.5±0.3）g的梭鱼幼鱼投喂6种不同脂肪含量的等氮等能饲料（脂肪水平分别为2.04%、4.83%、747%、979%、12.01%、14.59%），饲养60 d，试验结束后测定各组梭鱼肝脏中FAS的生物活性及肝脏、腹腔脂肪、肌肉中FAS mRNA的表达丰度。结果表明，随着饲料脂肪水平的升高，肝脏中FAS活性呈降低趋势，14.59%组的活性显著低于2.04%、4.85%组（P<0.05）；肝脏中FAS的mRNA表达量显著下降（P<0.05）；肌肉和腹腔脂肪中FAS的mRNA表达量呈下降趋势，但各组之间差异不显著（P>0.05）。

关键词：梭鱼；脂肪水平；脂肪酸合成酶；克隆；基因表达分析活性；同源性；系统进化树

中图分类号： Q78；Q959.478文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0049-06

属鲻形目鲻科梭属鱼类，是温带浅海区重要的经济鱼类之一，具有广盐性、广温性、适应性广、病害少、味道鲜美等诸多优点，目前是江苏沿海正在开发的海淡水养殖新兴品种之一。在目前的养殖中，较易出现腹部肥大的症状：解剖后，可见肠道表面脂肪覆盖明显，肝脏肥大；此种体形与梭鱼本该具有的长流线形身体不符，不受消费者欢迎；有关梭鱼产生上述症状的原因，目前并无研究。鱼类内脏尤其是肝脏脂肪过度聚积，产生脂肪肝或腹部肥大，这些是由于脂代谢紊乱造成脂肪在内脏内的沉积而出现的病理、生理学改变，它的发生、发展跟脂代谢关键因子有重要联系，脂代谢关键因子在这一过程中到底如何作用？是否可以通过营养调控的角度减少或避免此类症状的产生？脂代谢相关的基因众多，脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，簡称FAS）是脂代谢过程中的关键酶之一。动物体内脂肪的沉积量是脂肪的合成和降解过程动态平衡的结果，其合成和分解过程都是通过一系列酶催化完成的。动物体脂沉积所需要的脂肪酸大多来自脂肪酸的全程合成，即由FAS催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸，FAS活性的高低对控制动物体脂沉积具有重要意义[1]。因此，本研究克隆了梭鱼FAS基因的cDNA部分序列，并与其他物种进行同源性比较、系统发生进化树分析组织特异性表达，为进一步研究梭鱼的脂肪代谢机制奠定分子生物学基础。此外，梭鱼的营养需求研究基础薄弱，配合饲料的生产主要借鉴其他杂食性鱼类的营养需要，不合理的营养水平也可能是产生腹部肥大的原因。作为水产动物重要的营养素之一，脂肪是鱼类重要的能源物质，不同的鱼对脂肪的需求不同，饲料中不合理的脂肪水平会导致鱼体腹部累积大量的脂肪[2-3]。因此，本研究针对饲料脂肪水平对FAS基因表达的影响进行初探，从营养和基因表达调控的角度了解梭鱼的脂质代谢，为梭鱼的健康养殖提供理论基础。

1材料与方法

1.1试验设计

基因克隆和组织特异性表达用鱼由江苏省响水县一个养殖场提供，鱼体质量约300 g，运回后饲养于体积约 3 000 L 的水泥池（3 m×1 m×1 m）中，用普通商品饲料喂养，适应2周后即挑选10尾健康的梭鱼，用MS-222麻醉，于无菌操作下解剖，取鱼皮、肌肉、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、胃、肠、腹腔脂肪、脑和鳃11种组织，用液氮速冻后于-80 ℃冰箱中保存备用。

脂肪水平试验用鱼由江苏省射阳县朱平水产苗种有限公司提供，运回后用5%食盐水消毒，然后放入水泥池（3 m×1 m×1 m）中驯养10 d，挑选540尾健康无伤、规格均一的鱼种[均质量（9.5±0.3）g]，随机分为6组，饲养于循环流水养殖桶中（规格：直径80 cm、高度70 cm、体积约300 L），每组设置3个重复，每个重复30尾鱼，分别投喂6种不同的饲料。6种饲料配制如下：以鱼油为脂肪源，添加水平分别为0、25%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%，进口鱼粉、豆粕等为主要蛋白源，制成脂肪含量分别为2.04%、4.83%、7.47%、979%、12.01%、14.59%，蛋白质含量为30.32%的6组等氮等能饲料，配方见已发表文献[4]。正式饲养期间，投饲率为鱼体总质量的3%～5%，每天分3次投喂，投喂时间为 06：30、12：30、18：30，试验期间除投喂外全天充氧，水温控制在（24±2） ℃，养殖60 d。试验结束后饥饿24 h，用MS-222对鱼进行麻醉，每个重复取3尾鱼，无菌操作下取肝脏、肌肉、腹腔脂肪用液氮速冻，然后放入-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2试剂及仪器

Trizol Reagent（Promega）、反转录酶M-MLV、RnaseH、TdT酶、Taq酶、连接酶、SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit试剂盒均购自TaKaRa（大连）；Taq酶、胶回收试剂盒、pUCm-T载体购自上海申能博彩生物科技有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α由无锡淡水渔业中心农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室保存；定量PCR采用进口Axygen PCR管。鱼FAS酶联免疫分析试剂盒购于上海江莱生物科技有限公司，其他常规化学药品均为分析纯。

荧光定量PCR仪（CFX96TM Real-Time PCR Detection Systerm，美国伯乐Bio-Rad公司）；普通PCR仪（T100TM Thermal Cycler，美国伯乐Bio-Rad公司）；冷冻型台式大容量高速离心机（Centrifuge 5804R，德国艾本德Eppendorf公司）；核酸蛋白测定仪（Biophotometer plus，德国艾本德Eppendorf公司）；超低温冰箱（Forma 900 series，美国热电Thermo公司）；多功能酶标仪（Infinite M200，瑞士帝肯Tecan集团公司）。endprint

1.3方法

1.3.1肝脏组织FAS活性测定称取适量的组织样品，按 1 ∶9 的质量体积比加入0.65%生理盐水制成10%匀浆液，3 000 r/min 离心15 min，取上清液进行测定，具体方法按照试剂盒说明书进行。

1.3.2引物设计与合成通过同源比对设计兼并引物，FAS-F和FAS-R扩增FAS中间片段。根据已经分离出的梭鱼FAS cDNA部分片段（GenBank登录号为KJ848474），使用Codehop原理设计FAS荧光定量引物F1和R1，根据梭鱼 β-actin的部分序列（GenBank登录号为EF638008.1）设计梭鱼β-actin荧光定量引物F2和R2，引物序列见表1，所有引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，扩增的片段为80～120 bp。

（2）cDNA第1条链的合成。按照反转录试剂盒说明书进行反转录反应，反应条件为：42 ℃ 40 min，90 ℃ 2 min；4 ℃下保温至关机，所得的模板（cDNA溶液）于-20 ℃保存备用。

（3）FAS基因中间片段的获得。使用兼并引物FAS-F/FAS-R扩增FAS中间片段，PCR反应体系见表2，反应条件为：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃ 10 min，-20 ℃保存产物。

2结果与分析

2.1梭鱼FAS基因的克隆与序列分析

使用梭鱼肝脏cDNA为模板，扩增梭鱼FAS cDNA部分片段，部分序列和氨基酸翻译结果见图1，序列长度为 920 bp，编码303个氨基酸，该序列已经登录GenBank，登录号为KJ848474。

为确定FAS的进化关系，从基因库中收集了军曹鱼（Rachycentron canadum，ACZ55138.1）、斑马拟丽鱼（Maylandia zebra，XP 004571519.1）、尼罗非鱼（Oreochromis niloticus，XP 003454104.1）、鳉鱼（Oryzias latipes，XP 004080750.1）、银鲫（Carassius gibelio，AHA42647.1）、团头鲂（Megalobrama amblycephala，AHK05976.1）、雞（Gallus gallus，NP99048.6）、老鼠（Rattus norvegicus，AAA41145.1）、人（Homo sapiens，AAH63242.1）、恒河猴（Macaca mulatta，XP 001113076.1）等FAS氨基酸序列。用ClustalW 1.8把梭鱼FAS氨基酸序列同它们进行同源性比较，同时使用上述比对结果，采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树（图2），上标数据为1 000次自展值Bootstrap检测的支持率。序列分析显示，梭鱼FAS基因与其他物种的同源性为74%～95%，与硬骨鱼类的FAS序列相似性最高，其中与军曹鱼、斑马拟丽鱼相似性达到95%。此外，梭鱼FAS基因与其他物种的FAS基因同源性也较高，与鸡、老鼠的同源性为80%、77%，与人、恒河猴的同源性为74%。以上结果显示，在氨基酸水平上，本试验所克隆到的 FAS 基因与其他物种具有高度的相似性，

判定是梭鱼的FAS基因，且FAS基因在进化过程中较为保守。

系统发育树表明，亲缘关系近的物种先聚在一起，如梭鱼、军曹鱼以及斑马鱼等硬骨鱼类形成聚类，然后才和亲缘性较远的人、鸡、老鼠、恒河猴形成聚类。说明亲缘性近的物种的FAS基因的同源性也高。

2.2梭鱼FAS基因mRNA组织特异性表达

梭鱼11种组织中FAS mRNA的表达丰度见图3。FAS mRNA在11种组织中均有表达，不同组织中的表达量部分之间差异显著（P<0.05），从高到低依次为脑、肝脏、腹腔肠系膜脂肪、肾、鳃、皮肤、胃、脾、心、肠、肌肉。在肌肉中表达量最低，高表达在脑、肝脏和腹腔肠系膜脂肪组织中，分别为肌肉中表达量的270.08、145.51、101.30倍，其余各组织中表达量均显著低于这3种组织（P<0.05）。FAS mRNA在肾、鳃、皮肤、胃和脾脏5种组织中有中等程度的表达，前4种组织中的表达量均显著高于脾脏（P<0.05）；在心脏和肠中表达量较低，但显著高于肌肉（P<0.05）。

2.3饲料脂肪水平对梭鱼肝脏中FAS活性的影响

饲料脂肪水平对梭鱼肝脏中FAS活性的影响见图4。随脂肪水平的升高，肝脏中FAS活性呈下降趋势，脂肪水平为204%、4.83%、7.47%、9.79%、12.01%组之间差异不显著（P>0.05），14.59%组显著低于2.04%、4.83%组（P<0.05）。

2.4饲料脂肪水平对梭鱼FAS mRNA表达水平的影响

梭鱼肝脏、腹腔脂肪、肌肉组织中FAS mRNA的相对表达量见图5至图7。随着饲料脂肪水平的升高，肝脏中FAS mRNA的表达丰度逐渐下降， 4.83%、 7.47%、9.79%这3组

之间差异不显著，12.01%、14.59%这2组之间差异不显著，但均显著低于2.04%、4.83%组。腹腔脂肪和肌肉中FAS mRNA的表达丰度随脂肪水平的升高呈下降趋势，但各组之间差异均不显著（P>0.05）。

3结论与讨论

FAS是脂肪合成过程中的一个关键酶，催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸，对于控制动物体脂的沉积具有重要意义，开展FAS基因的克隆及表达分析，有助于从分子学的角度探索脂肪代谢和合成的规律。鱼类中有关FAS基因的研究相对较少，主要有军曹鱼、斑马拟丽鱼、罗非鱼、团头鲂等，因此鱼类FAS基因的结构、功能和表达信息还有待于进行大量的研究。本研究从梭鱼中克隆了FAS cDNA的部分序列（GenBank登录号为KJ848474），长度为920 bp，编码303个氨基酸。通过系统进化树分析可知，FAS基因具有较高的保守性，梭鱼和其他物种相似性较高，其中和鱼类的相似性最高。endprint

有关FAS mRNA的组织特异性表达，已有研究者在不同的生物体内作了研究，但研究结果各不相同。在番鸭的研究中发现，FAS mRNA在肝脏和腹脂中表达量最高，在脾脏、肺脏和下丘脑中表达量次之，在心脏、肾脏、肌胃、腺胃、胸肌、腿肌、十二指肠中表达量很少或几乎不表达[6]。但在猪体内，FAS mRNA高表达在脂肪组织、肝脏、小脑和胃中[7]。匙吻鲟肝脏中FAS mRNA的表达量最高，其次是腹腔脂肪，肌肉、肠道、心脏、鳃、鳍条、眼睛、胃和吻这8种组织中只有少量的表达[8]。而鳙鱼咽上组织中FAS mRNA表达量最高，其次是肠道组织，在肝脏、肌肉、心脏、鳃、鳍和眼中的表达水平显著低于咽上器官[8]。覃川杰在瓦氏黄颡鱼的研究中指出，FAS mRNA主要在肠道、肝脏、腹腔脂肪、肌肉和脑组织中表达，肠道中最高，肝脏中次之，显著高于后几种组织[9]。本研究发现，FAS mRNA在梭鱼脑、肝脏和腹腔肠系膜脂肪组织中有高表达，在肾脏、鳃、皮肤、胃、脾脏中有中等程度的表达，心脏、肠和肌肉组织中表达量较低。以上结果表明，FAS mRNA的组织特异性表达在不同物种中既有一定的相似性（高表达一般在肝脏、腹腔脂肪组织），又有一定的差异性。不同物种不同组织合成脂肪的能力有所不同，猪主要在脂肪组织中合成脂肪，禽类和鱼类主要通过肝脏合成脂肪[10-12]。基于不同时空条件和不同的发育阶段，同一组织细胞所处的状态各不相同。Kusakabe等指出，FAS较高表达出现在脂质代谢旺盛的细胞（如脂肪细胞、肝细胞、皮脂腺等）、处于增殖状态的细胞（如胎儿消化呼吸系统增殖上皮、胃、十二指肠上皮细胞）以及对激素敏感的细胞（如垂体前叶、乳腺、前列腺、子宫内膜等）中[13]。这些可能是以上不同物种FAS mRNA组织表达差异性的原因。Semenkovich指出，机体组织中FAS mRNA表达水平的升高会增加甘油三酯在组织内的沉积而导致肥胖[14]。夏晓杰等的研究也表明，齐口裂腹鱼肌间脂肪含量与FAS mRNA表达水平呈一定的正相关关系[15]。而FAS mRNA在不同组织中的差异性表达是否会导致不同组织中脂肪的蓄积程度不同？目前该方面的研究已在肝脏和肌肉中有少量结果，即肝脏是鱼类合成脂肪的主要场所及脂肪蓄积的调节性储脂器官[16-17]。在瓦氏黄颡鱼[9]、吉富罗非鱼[18]、齐口裂腹鱼[15]中的研究均表明，肝脏中FAS基因的表达水平显著高于肌肉中，这可能是导致鱼类肝脏和肌肉脂肪蓄积差异的主要原因。研究鱼类脂代谢相关基因的组织差异性表达，可以从分子生物学的角度调控鱼体脂肪的沉积，为提高鱼体健康和鱼肉品质提供理论依据。

动物体内FAS活性的高低，受日粮营养素的影响，其中日粮中脂肪含量的高低及脂肪酸种类对FAS的活性起着重要的决定作用。有研究表明，饲料中脂肪水平的升高，会抑制鱼类FAS的活性[19-20]。本研究发现，随着脂肪水平的升高，肝脏中FAS活性逐渐降低，进一步证实了高脂对FAS活性的抑制作用，中华绒螯蟹和白甲鱼的研究也得到了相同的结论[21-22]。Weiss等指出，当饲料提供的外源性脂肪酸充足时，不需要合成内源性脂肪酸，因此FAS活性下降[23]。而Clarke等研究发现，日粮中脂肪对FAS活性起抑制作用，主要是脂肪酸抑制FAS基因的表达，这种抑制发生在转录水平，导致脂肪的合成减少，这种抑制能力和脂肪酸的数量、种类有关[24-25]。本研究中所采用的鱼油含有大量n-6和n-3系列不饱和脂肪酸，是FAS表达的强抑制剂，因此高脂水平时FAS活性显著下降。

FAS基因的表达受激素、摄食营养成分等的影响[14]。大鼠在饲喂高碳水化合物饲粮时，肝脏中FAS mRNA的表达量约为绝食时的100倍；喂高脂（玉米油和牛脂1 ∶1混合）日粮时FAS mRNA的表达量比绝食时有所增加，但只有喂高碳水化合物时表达水平的4%[26]。大量研究表明，日粮中的脂肪酸对FAS基因的表达有抑制作用。抑制作用的强弱和脂肪酸的数量、碳链长度、双键位置、双键数量有关。第1个双键的位置为n-9时（位于碳链甲基端第9、第10个碳原子之间），对FAS表达的抑制作用和饱和脂肪酸类似，基本无影响；第1个双键位于n-3时（在碳链甲基端第3、第4个碳原子之间），抑制作用比位于n-6强（在碳链甲基端第6、第7个碳原子之间）[24，27-28]。Ikeda等指出，二十二碳六烯酸（docosahexa enoic acid，简称DHA）、二十五碳五烯酸（eicosapenta enoic acid，簡称EPA）和亚麻酸相比，显著降低了肝脏中FAS活性及肝脏和血浆中甘油三酯的浓度，DHA和EPA相比，DHA更有效，这说明同一系列的脂肪酸，双键数量多的对FAS表达的抑制作用更强[29]。本研究发现，脂肪水平的升高，显著降低了梭鱼FAS mRNA的表达量，脂肪水平483%、7.47%、9.79%组表达量显著低于2.04%、4.83%组，12.01% 、14.59%组表达量显著低于其余各组，这可能是由于高脂肪水平的摄入，准确来讲是大量的n-3和n-6系列多个饱和脂肪酸（polyunsa thrated fatty acid，简称PUFA）的摄入，使FAS基因的表达受到了抑制。这和马晶晶报道的饲料中含有较高含量的n-3高度不饱和脂肪酸（highly unsaturated fatty acid，简称HUFA，大于0.88%）时，黑鲷幼鱼FAS基因表达量显著下降的结论[30]是一致的。Clarke等在大鼠的研究中也指出，含有丰富PUFA的鱼油和红花油可以使肝脏中FAS mRNA的表达量降低75%～90%[26]。本研究中随着脂肪水平的升高，腹腔脂肪和肌肉组织中FAS mRNA的表达量仅表现出下降趋势，各组之间差异并不显著；这可能和不同组织基因表达的特异性有关，Clarke指出，脂肪酸对FAS基因表达的抑制具有组织专一性，肝脏中FAS基因的转录量决定了FAS mRNA的水平，但脂肪组织中FAS mRNA 的水平除了取决于基因的转录量外，还和影响FAS mRNA稳定性的因素有关[23]。目前，这方面的研究较少，尚需更深入的研究。endprint

本研究克隆了梭鱼的FAS基因部分cDNA序列，通过系统进化树可知，FAS基因具有较高的保守性，梭鱼和其他物种相似性较高；FAS基因在梭鱼不同组织中的表达丰度差异显著，在脑、肝脏和腹腔脂肪组织中高表达，在肌肉中表达量最低；饲料脂肪水平能够抑制梭鱼肝脏中的FAS活性和 mRNA的表达丰度，水平高时抑制作用更显著。

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