周洁+温亮+周黎+王方+矫振彪+吴金平

摘要：超低温疗法相对传统脱毒方法具有操作相对容易、时间周期短、脱毒率高等优势。从超低温疗法原理、种类及优势等方面进行了阐述，并展望了通过处理材料不同生理状态研究、优化预培养因子等技术，可有效提高超低温疗法在薯芋类蔬菜脱毒上应用。

关键词：超低温疗法；脱毒；薯芋类蔬菜

中图分类号：S632 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4697-03

薯芋类蔬菜在生产上多采用无性繁殖方式，易导致植物体内病毒的逐代积累，致使种性退化、抗逆性下降、品质变劣，最终导致大幅减产[1]。如生姜因种姜病毒的积累就可导致5%～45%的减产，马铃薯病毒一般也可导致20%～50%的减产，严重时可达80%以上，仅马铃薯上发现的病毒已多达25种[2]。由此可见，植物病毒已严重制约薯芋类蔬菜产业的健康发展。而目前对于素有“植物癌症”之称的植物病毒，国内外却尚无高抗病毒品种和高效杀病毒药剂[3]。

生产上常采用脱毒苗来应对病毒给农业带来的巨大损失，而植物组织脱毒培养技术是目前获得脱毒植株最有效的方法。脱毒植株和带毒植株相比，其光合作用、抗氧化酶活性、叶绿素含量等具有显著差异，脱毒植株长势更好，可提升产品质量和产量[4，5]，具有明显种性优势。热处理结合茎尖培养法等常规脱毒方法普遍存在操作困难、费时、脱毒不完全、植株成活率低等缺点[6]。而基于超低温保存的新型植物脱毒方法，即超低温疗法能很好解决以上问题[7]。与传统组织培养脱毒技术相比，超低温疗法脱毒率可提高23%～100%，脱毒率平均可提高53%[8]。同时，超低温疗法脱毒率不受茎尖大小影响，操作更为简便，还可以同时实现种质保存和病毒脱除。

1 超低温疗法原理

2006年Wang等[9]首次将超低温保存脱毒技术定义为超低温疗法（Cryotheraphy），即基于超低温保存对细胞的选择性破坏原理[10]，将感染病原体（病毒、植原体、细菌）的材料经液氮（-196 ℃）短暂处理后脱除病原体的技术[11]。同时陈芳等[12]也对超低温疗法脱毒原理进行了解释。超低温疗法一般选取植物茎尖，病毒一般通过维管束传播，靠近顶端分生组织的细胞，维管束较少或尚未形成，带毒较少，且质合比大、液泡小、自由水含量低，超低温保存时易脱水，不易形成冰晶，超低温保存后易成活；而远离顶端分生组织的细胞，已形成较多维管束，带毒量高，且核质比小、液泡大、自由水含量高，超低温保存时不易脱水，易形成冰晶，超低温处理后不易成活。因此，利用茎尖组织细胞结构差异，在进行超低温处理后，茎尖带毒的组织细胞基本不能成活，而有较少病毒甚至不带病毒的细胞得以存活，由这部分成活细胞发育成的植株可能是无毒的，由此获得无病毒植株。前人通过该方法已成功去除了大蒜普通潜隐病毒、马铃薯病毒等[13，14]。

2 超低温疗法的种类

目前，常用的超低温疗法主要包括玻璃化法、包埋脱水法、包埋玻璃化法和小滴玻璃化法等方法，其差異在于茎尖的玻璃化处理。赵喜亭等[15]研究表明，玻璃化超低温疗法是在超低温保存冰冻前，将材料置于由一定比例非渗透性和渗透性保护剂组成的玻璃化溶液（PVS）进行处理，在高降温速率下使细胞中液体固化为无定形的玻璃化状态，并以该状态进行低温保存，该方法由于保护剂浓度高，对材料毒害作用较大，对脱水过程和保护剂渗透性需严格控制，且同一时间处理材料有限。而Fabre等[16]利用褐藻酸钙将材料包埋后放置高浓度蔗糖培养基中预培养，利用无菌空气流脱水，投入液氮中贮存的包埋脱水法，弥补了玻璃化法的不足，但相对玻璃化法脱水时间长、组织恢复生长慢、部分植物材料成苗率低。包埋玻璃化法是在包埋脱水法和玻璃化法的基础上发展出来的，将材料放入氯化钙和硅藻酸盐组成的包埋液形成小球后置于玻璃化溶液中脱水，然后液氮保存[17]，该方法存活率可高达90%，脱水时间短，材料恢复生长较快，方法简便易操作。而目前广为应用的小滴玻璃化法是一种相对较新的方法，即材料经预培养后用装载液和玻璃化液对材料进行处理，随后将材料转入滴有3～15 μL PVS2铝箔条上形成小滴，再将铝箔条放入装有液氮的冷冻管中，然后液氮保存[18]，该方法具有存活率、再生率高、适用性广、处理量大、操作简单等特点。

3 超低温疗法的优势

与传统的脱毒方法相比，超低温疗法具有明显优势。首先超低温疗法的脱毒率不受茎尖大小限制，操作更简便。常规茎尖培养脱毒率与茎尖大小成反比，但成活率与茎尖大小成正比[19]。因此一般切取茎尖0.2～0.4 mm，该技术对操作人员要求较高，且茎尖易褐化，成活率低。而超低温疗法细胞存活率与细胞特性相关，因此不受茎尖大小限制，操作难度大大降低。其次超低温疗法周期短。目前常用的热处理结合茎尖培养的脱毒方法中，热处理一般为30 d左右，超低温疗法通常无需热处理，试验周期大大缩短。此外，超低温疗法还有脱毒率高的特点。利用超低温疗法可使根状茎的PPV脱毒率达到50%，是茎尖培养脱毒率的2倍[20]。白建明等[21]在研究超低温疗法和其他3种常规脱毒方法比较中发现，马铃薯茎尖通过超低温疗法脱毒率达到59.13%，而热处理结合茎尖培养法脱毒率为56.02%、热处理法脱毒率为42.61%、茎尖培养法脱毒率为35.83%，同时超低温疗法的再生植株于对照植株在形态学上无显著差异。由此可见，超低温疗法较常规脱毒法操作相对容易、时间周期短、脱毒率高等，为植物脱毒提供了一条新途径。

4 超低温疗法在薯芋类蔬菜中的应用

超低温疗法目前在薯芋类蔬菜脱毒中的研究有限，多集中于种质资源超低温保存体系的建立和优化。曾琳等[22]研究表明利用玻璃化超低温保存处理的高良姜种子活力可达到72.67%。杜来顺等[23]发现经玻璃化超低温保存后的生姜试管苗丛生芽成活率可达到57.7%。利用茎尖包埋玻璃化法对江西山药多种基因型进行超低温保存，成活率约为40%～85%，同时再生植株的遗传稳定性良好[24]。采用茎尖包埋玻璃化法超低温冷冻技术保存徐薯18号，茎尖存活率可高达85%以上[25]。经过超低温保存后的魔芋花粉，具有明显的冷刺激现象，比新鲜花粉离体萌发率更高[26]。王子成等[27]通过超低温疗法成功脱除马铃薯S病毒和Y病毒，其中马铃薯S病毒脱毒率为47%，显著高于茎尖培养法脱毒率17%，马铃薯Y病毒脱除率达到83%，高于茎尖培养法的62%。由此可见，薯芋类蔬菜的无性繁殖存在种性退化、病毒积累的问题，造成种质优良性状的丢失，而超低温疗法能在保存优良种质资源的同时达到脱毒的目的，是一种新型高效的脱毒技术。endprint

5 展望

中国薯芋类蔬菜资源丰富，生态类型多样，其种质资源的保存以及克服生产上无性繁殖导致的病毒积累具有重要意义，因此薯芋类蔬菜的超低温疗法体系的建立显得十分重要。在薯芋类蔬菜的超低温疗法研究中，该技术体系的适用性、易操作性、使用效果等需要不断进行优化。不同种类薯芋类蔬菜以及同种蔬菜的不同生长发育时期状态的不同，应有针对性建立具有稳定存活率和脱毒率的超低温疗法技术体系，为该技术在生产中的广泛应用提供技术支持。为了在超低温疗法中得到较高的成活率，主要通过优化加入适宜浓度的蔗糖类渗透保护物质、添加水杨酸类化学成分和低温锻炼等预培养条件，增强处理材料对高度脱水和剧烈温度变化的耐受性，从而提高超低温疗法效率[28]。加强超低温疗法过程中组织细胞的结构变化研究，通过对细胞水平的研究，明确处理材料不同生理状态时超低温处理对其影响，从而对有针对性的进行材料的选取和预处理等条件的优化。

综上所述，虽然目前超低温疗法在薯芋类蔬菜上研究处于初级阶段，在植物病毒脱除的巨大潜力还有待于进一步研究开发。同时对于超低温保存和脱毒后植株遗传稳定性及生理生化、分子水平的变化等都将是今后的研究重点。随着超低温疗法应用研究的不断深入及相关技术设施的不断完善，其作为一种新型的种质保存和脱除病毒技术将得到广泛应用。

参考文献：

[1] 黄 鑫，陈万生，张汉明，等.生物技术在药用植物研究与开发中的应用和前景[J].中草药，2015，46（16）：2343-2354.

[2] SALAZARL F. Potato Viruses and Their Control[M].Lima，Peru：International Potato Center，1996.

[3] 钱亚娟，徐 毅，周 琦，等.利用深度测序技术发掘植物病毒资源[J].中国科学（生命科学），2014，44（4）：351-363.

[4] 栾运芳，王建林，大次卓嘎.脱毒马铃薯光合及增产机理的研究[J].西南农业学报，2001，14（2）：38-40.

[5] 蔡 蕊.紫色甘薯脱毒技术及其生理生化指标分析[D].长春：吉林师范大学，2013.

[6] MINK G I，WAMPLE R，HOWELL W E. Heat Treatment of Perennial Plants to Eliminate Phytoplasms，Viruses，and Viroids While Maintaining Plant Survival[A].Paul S T. In：Plant Virus Disease Control[M]（Hadid A，Khetarpal R K，Koganezawa H，eds），MN：APS Press，The American Phyto Pathological Society，1998.

[7] CUI Z H，LI B Q，BI W L，et al. Plant pathogen eradication by cryotherapy of shoot tips：Development，achievements and prospective[J].Acta Horticulturae，2015，1083：35-41.

[8] WANG B，WANG R R，CUI Z H，et al. Potential applications of cryogenic technologies to plant genetic improvement and pathogen eradication[J].Biotechnology Advances，2014，32（3）： 583-595.

[9] WANG Q C，LIU Y，XIE Y，et al. Cryotherapy of potato shoot tips for efficient elimination of potato leafroll virus（PLRV） and potato virus Y（PVY）[J].Potato Research，2006，49（2）：119-129.

[10] ENGELMANN F. Plant cryopreservation：Progress and prospects[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology，2004，40：427-433.

[11] WANG Q C，VALKONEN J P T. Cryotherapy of shoot tips：Novel pathogen eradication method[J].Trends in Plant Science，2009，14（3）：119-122.

[12] 陳 芳，王子成.植物脱毒新技术——低温疗法[J].河南农业科学，2006，35（12）：11-13.

[13] VIEIRA R L，DA SILVA A L，ZAFFARI G R，et al. Efficient elimination of virus complex from garlic（Allium sativum L.） by cryotherapy of shoot tips[J].Acta Physiologiae Plantarum，2015，37（1）：1733.

[14] 王子成，曲 先，薄 涛.超低温保存脱除两种马铃薯病毒[J].河南大学学报（自然版），2011，41（6）：609-614.

[15] 赵喜亭，宋萍萍，王 苗，等.玻璃化超低温保存对怀菊花再生苗形态及生理的影响[J].湖北农业科学，2011，50（3）：533-535.endprint

[16] FABRE J，DEREUDDRE J. Encapsulation-dehydration：A new approach to cryopreservation of Solanum shoot-tips[J].Cryo Letters，1990，11（6）：413-426.

[17] 吴雪梅，汤浩茹.包埋玻璃化法超低温保存植物种质的研究进展[J].植物学报，2005，22（2）：238-245.

[18] 黄修梅，惠 霖，袁春爱，等.超低温疗法脱除马铃薯种薯病毒病的研究进展[J].种子，2015，34（3）：50-54.

[19] 孙 琦，张春庆.植物脱毒与检测研究进展[J].山东农业大学学报（自然科学版），2003，34（2）：307-310.

[20] BRISON M，DE BOUCAUD M T，PIERRONNET A，et al. Effect of cryopreservation on the sanitary state of a cv Prunus rootstock experimentally contaminated with Plum Pox Potyvirus[J].Plant Science，1997，123（1-2）：189-196.

[21] 白建明，陈晓玲，卢新雄，等.超低温保存法去除马铃薯X病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒[J].分子植物育种，2010，8（3）：605-611.

[22] 曾 琳，何明军，陈 葵，等.高良姜种子超低温保存研究[J].中国农学通报，2014，30（28）：164-168.

[23] 杜来顺，冯建军，李晓华，等.生姜玻璃化法超低温保存技术[J].北方园艺，2014（13）：123-125.

[24] 尹明华，徐志坚，章省琴，等.江西山药茎尖包埋玻璃化法超低温保存及其遗传稳定性检测[J].浙江农业学报，2016，28（6）：984-991.

[25] 田 霄，侯夫云，王庆美，等.甘薯茎尖超低温保存技术研究[J].山东农业科学，2010（5）：55-56.

[26] 張玉进，张兴国，刘佩瑛.魔芋花粉的低温和超低温保存[J].园艺学报，2000，27（2）：139-140.

[27] 王子成，曲 先，薄 涛.超低温保存脱除两种马铃薯病毒[J].河南大学学报（自然版），2011，41（6）：609-614.

[28] 钟 兰，刘玉平，彭 静.植物种质资源离体保存技术研究进展[J].长江蔬菜，2009（16）：4-7.endprint