赵宁宁，张正，王彦博，师长宏*

(第四军医大学 1. 实验动物中心； 2. 基础医学院四大队, 西安 710032)

PDX(patient-derived xenograft, PDX)模型由于缺乏免疫系统不能用于肿瘤免疫反应方面的研究，完整的该模型在传代中人的基质成分会逐渐被小鼠代替，肿瘤基因分子异质性不能长久保持，在药物靶向治疗及肿瘤发生机制研究方面具有一定的局限性[1-2]。而将人的造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)移植于X线照射的重度免疫缺陷小鼠，然后再将患者的瘤组织移植于该小鼠建立人源化肿瘤模型(humanized patient-derived xenograft, Hu-PDX)，可以给肿瘤提供与人体更相似的生长环境，同时，肿瘤基质包含了人的免疫细胞及细胞因子等成分，在肿瘤靶向治疗与肿瘤发生、发展、转移机制研究方面具有重要的应用价值，尤其在研究肿瘤免疫治疗方面，是更理想的肿瘤模型[3-5]。本文将对Hu-PDX模型的研究进展进行系统的阐述。

1 Hu-PDX模型的建立方法

Hu-PDX模型的建立分两大部分：(1)免疫系统人源化小鼠(humanized immune system mice, HISM)。常用免疫系统重建方法有三种：一种是将人的骨髓、肝、胸腺组织共移植于小鼠体内(bone marrow-liver-thymus, BLT)，这种模型虽然免疫重建效果较好，但是免疫重建材料来源有限，且对患者的创伤很大，不适宜用作临床患者个体化治疗的研究[1]；还有一种方法是将人的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)移植于小鼠体内，这种方法操作简单，且可获得较大量的细胞，但是移植的PBMCs产生的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)限制了小鼠体内T细胞和NK细胞的产生，而且移植后4周左右小鼠会出现严重的移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease, GVHD)，从而限制了利用模型做实验的时间；将人血CD34+HSCs(使用免疫磁珠方法从PBMCs中分离)移植于免疫缺陷小鼠体内是目前制备Hu-PDX模型较常采用的方法[3]，通过检测CD34+的表达评估骨髓移植的效果，也可以作为扩增HSCs的标记，该类干细胞具有很强的增殖能力。据文献报道，CD34+HSCs在体内可以分化成呼吸道上皮细胞、肝细胞、心肌细胞等[6-8]。脐带血中含有较多的HSCs，将CD34+脐带血HSCs移植入小鼠体内后，可以分化成人CD45+、CD3+和CD151+等细胞，从而成功建立HISM模型。但是，使用脐带血HSCs建立的HISM体内免疫环境无法与人的肿瘤组织相匹配，将患者的肿瘤组织移植入此类HISM后，其免疫系统并不能与原发瘤相对应[2-4]。如果将患者外周血的HSCs移植于小鼠体内后建立HISM，该小鼠体内微环境与患者肿瘤组织生长环境相似，可以使肿瘤特性与患者更相似。正常情况下，人外周血中CD34+HSCs较少，不能提供足量的移植用细胞，而化疗后患者骨髓再生的早期CD34+HSCs显著增加，此时给予患者注射粒细胞刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)，则骨髓增生加快，骨髓腔内压力升高，外周血中的CD34+HSCs会进一步增多[9-10]。因此，从动员后患者外周血中可分离较多的CD34+HSCs；进一步加入干细胞刺激因子Flt3、SCF和IL-3等扩增培养，然后移植于骨髓破坏的免疫缺陷小鼠体内，则可建立更有效的HISM，该小鼠可用于进一步建立免疫系统与肿瘤组织来源于同一个患者的Hu-PDX模型[11]。(2)患者的肿瘤组织移植入HISM小鼠建立Hu-PDX模型。通常免疫缺陷小鼠接种人免疫细胞(HISM)4周后将患者肿瘤组织移植于其体内，肿瘤能够生长，且小鼠体内产生的人源性免疫细胞成分及细胞因子等与肿瘤之间相互作用，在模型肿瘤组织中能够检测到人的免疫治疗靶点和细胞因子等，肿瘤在病理形态及基因完整性等方面显示出更好的肿瘤异质性，标志Hu-PDX模型建立成功[12-13]。

2 Hu-PDX模型建立成功的影响因素

Hu-PDX模型是否能够建立成功与HSCs的数量和小鼠品系的选择等因素密切相关。外周血PBMCs中分离的CD34+HSCs使用干细胞专用无血清培养基联合细胞因子Flt3、SCF、G-CSF等的刺激能够扩增数十倍，足够的细胞数量也是保证免疫重建成功的前提条件，文献报道每只小鼠移植量必须不低于5×105个[5,7]；不同品系的免疫缺陷小鼠都可用作实体瘤的移植，然而由于人免疫细胞的生存需要高度依赖兼容性信号，很容易在宿主吞噬信号的作用下被吞噬，这些小鼠并不都适合建立人源化免疫系统(humanized immune system, HIS)[13-14]。通常被用作建立人源化小鼠模型的小鼠有：NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjill/SzJ)、NOG(NOD.CgPrkdcscidIL2rgtm1Sug/JicTac)、BRG(C.Cg-Rag1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ)。NOD(非肥胖糖尿病)背景的小鼠有NK细胞功能缺陷；SCID(严重联合免疫缺陷)是一种功能缺失突变即影响DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK), 一种在T细胞和B细胞发育的过程中参与V(D)J重组的DNA修复酶。因此，SCID小鼠体内T细胞和B细胞水平降低。失活的白介素-2(IL-2)受体γ-链导致T细胞和B细胞发育障碍并阻止NK细胞产生。重组激活基因1(RAG1)是V(D)J重组的必要条件；因此，RAG1失活突变影响T细胞和B细胞的发育。以上几种品系小鼠在有功能的人免疫细胞移植方面表现出细微差别。PBMCs移植免疫缺陷小鼠一般免疫成分可以保持2～5周。将CD34+HSCs注射入这些小鼠体内会产生主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)限制了T细胞和B细胞，以及单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的数量，通常人的免疫细胞成分在小鼠体内可以保持8～9周。另外，有些品系小鼠经过基因改造后可以产生多种人类细胞因子，进一步刺激造血系统的分化。比如，NOG-GM3小鼠表达人IL-3和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，NSG-SGM3小鼠表达人IL-3，GM-CSF和SCF(也称为KIT ligand)，MISTRG小鼠表达人IL-3，GM-CSF和巨噬细胞CSF(也叫CSF1)。这些小鼠体内信号监管蛋白-α(SIRPα)和促血小板生成素(THPO)的产生增加了人骨髓、肥大细胞、调节性T细胞和NK细胞的数量[13-15]。文献报道[15-16]，使用PBMC移植NOG/NSG/BRG小鼠建立的HISM只能产生T细胞和NK细胞，而使用CD34+HSCs移植NOG/NSG/BRG/ NOG GM3/ NSG SGM3小鼠建立的HISM可以产生人的T细胞和B细胞，以及单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞，使用CD34+HSCs移植MISTRG小鼠建立的HISM可以产生除人T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞以外的NK细胞，MISTRG小鼠目前最合适用作建立HISM和肿瘤移植，用于制备Hu-PDX模型体现出良好的应用前景。肿瘤类别不同移植成功率具有较大差别，肿瘤本身的恶性程度与移植成功率具有正相关性，此外，移植部位、肿瘤新鲜度、清洁度及在运输过程中的保存等与移植的成功率也有一定的关系[16-17]。

3 Hu-PDX模型在临床前中的应用

3.1 免疫治疗

人类免疫系统成功移植入小鼠体内建立HISM 模型的一个基本特性是具有抗肿瘤免疫反应能力。研究人员通过移植人免疫系统和头颈部肿瘤，成功建立了具有免疫治疗靶点的Hu-PDX模型[18-19]。在最近一项研究中，Sanmamed等[ 20]将胃癌患者的淋巴细胞注射到Rag 2-/--Il2γnull小鼠后，这些细胞在小鼠体内被激活并重新分布到小鼠体内各部位，流式检测显示，小鼠体内产生了人CD3+、CD4+、CD8+细胞，4周左右产生了GVHD，人PD-1主要由T细胞及其亚群诱导产生，人CD137主要由CD8+T细胞诱导产生；当该小鼠注射nivolumab(纳武单抗，一种PD-1抑制剂)和urelumab(一种抗CD137的激动剂)后GVHD反应加重；进一步将同一个患者的胃癌组织移植到该方法建立的HISM体内，上述药物的使用会诱导自身T细胞的攻击，减缓肿瘤的生长[20]。另外，目前肿瘤免疫调节靶向治疗也是一个热点，Chang等[8]使用PBMCs建立的人源化肾细胞癌原位模型用于检测靶向碳酸酐酶IX蛋白的有效性，结果显示该抗体诱导产生的T细胞能够抑制肿瘤生长。Hu等[ 21]联合移植人胎胸腺组织和转染人HLA I类限制性黑素瘤抗原(MART-1)TCR基因的CD34+HSPCs成功建立了HISM模型，这种小鼠体内可以产生MART-1-TCR+人T细胞；这些T细胞在体外可以用来观察特异抗原对黑色素瘤细胞的攻击；当这些T细胞移植到NSG黑色素荷瘤小鼠后，动物的生存时间显著延长[21-23]。另外，目前Ipilimumab(易普利姆玛，靶向CTLA-4)单克隆抗体，nivolumab(靶向PD-1)和urelumab(靶向PD-1)已经在免疫靶向治疗方面获得了较好的效果。

3.2 精准医学靶向治疗

没有经过分子筛选的肿瘤靶向治疗有效率仅在10%～20%之间[17]，而人们依据药物有效的分子特点和肿瘤的异质性对患者进行分层则取得了良好的效果。比如将小细胞肺癌患者按照EML-4-ALK+进行分层，其靶向治疗药物ALK激酶对小细胞肺癌EML-4-ALK+的抑制反应明显增加[24]。然而即使给患者分层，临床反应也是短暂的，在疾病进展前通常只有6～12个月[17]，因此了解肿瘤的异质性仅仅是提高药物疗效的第一步。肿瘤细胞群对外界环境的适应能力特别强，可以很快进化为没有免疫系统的微环境的一部分。当人的肿瘤组织移植到免疫缺陷鼠后，由于鼠系的微环境缺乏免疫系统，因此治疗结果往往与患者不一致。文献报道[18-19]，虽然PDX模型较好的保持了肿瘤异质性，但在传代过程中也会丢失部分基因，因此，PDX模型用于精准医学靶向治疗具有一定的局限性。

Hu-PDX模型呈现出与人体内相似的动态微环境。在该模型中人们发现肿瘤细胞释放的趋化因子与基质产生的信号之间会相互影响[11]。如，癌细胞由于基因突变会产生异常的表面抗原，通常这些抗原会遭受循环T细胞和NK细胞攻击，而癌细胞产生的细胞因子可以同化附近的免疫细胞并逃脱免疫监视；另外，癌细胞表达的配体也可抑制效应免疫细胞信号转导[15]。在Hu-PDX模型中发现，趋化因子CCL22可以诱导调节性T细胞产生，而调节性T细胞产生的细胞因子TGF-β和IL-10可以下调附近的免疫细胞活性，同样，许多细胞因子，包括CCL2，HIF-1α和VEGF可以募集肿瘤细胞中的循环单核细胞和髓源性抑制细胞(MDSC)，这些细胞又可以在肿瘤内分化成相关巨噬细胞(TAMs)，许多TAMs快速从M1型巨噬细胞转换为M2型巨噬细胞，从而抑制其他细胞的免疫活性，促发肿瘤的生长[6,11]。此外，在Hu-PDX模型中肿瘤和/或抗原呈递细胞表达的配体可以抑制效应免疫细胞的免疫检查点受体，如细胞程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1, PD-1)，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T lymphocyte associate protein-4, CTLA-4)[6]。这种动态的微环境促使Hu-PDX模型中肿瘤组织能够更好的保持肿瘤基因序列的完整性，PD-1等信号通路的存在也为肿瘤的靶向治疗提供与人体更相近的生长环境。如，免疫重建的人头颈部肿瘤Hu-PDX模型不仅可以较好的保持肿瘤分子的异质性而且可以将部分丢失的基因重现。Horn等[16]报道，以T细胞作为效应细胞的双特异性单链抗体(Bi-specific T cell engagers, BiTEs)，即，一种基因工程联合蛋白，特异性靶向细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1)阳性肿瘤细胞和CD3+PBMC，通过CD3复合物和靶向活化的肿瘤T细胞诱导了细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的产生，进而杀死PD-L1的肿瘤细胞，延长人源化荷瘤小鼠的生存时间，但是这种靶向药物对于不存在PDL1+信号通路的肿瘤组织是无效的。因此，Hu-PDX模型对肿瘤异质性的保留能力和它的人源化特性决定了它在精准靶向医学治疗中的重要性[25-26]。

3.3 肿瘤发生发展与转移机制的研究

肿瘤的发生是由细胞和其周围的微环境相互作用造成的。患者体内的原发肿瘤微环境参与了肿瘤细胞的诱导、产生、发展及转移等。在肿瘤间质与肿瘤的相互作用过程中，肿瘤从外界获得营养物质，逐渐生长出新的血管，增加了肿瘤细胞的转移和侵袭能力。当部分肿瘤细胞从原发部位脱落，进入局部血管组织，便会随着血液循环在适应的新部位形成继发肿瘤转移灶[27-28]。研究报道Hu-PDX模型微环境与原发肿瘤更相似，在肿瘤生长的过程中能够更好的反应肿瘤与肿瘤间质的相互作用，为肿瘤的生长、发展、转移等的研究提供了更可靠的研究工具[29]。如，Hu-PDX模型小鼠体内含有人源化调节淋巴管及人细胞因子，它们具有免疫监控、炎症和致瘤作用，可以与肿瘤之间相互影响[30-31]。

4 Hu-PDX模型的不足

为了避免由人HLA不匹配而引起的免疫反应，Hu-PDX模型的建立，至少要求造血干细胞来源与肿瘤来源患者的HLA相匹配，而最理想的是造血干细胞来源与建立PDX模型的肿瘤来源是共同患者[3,6]。但是，从癌症患者分离造血干细胞并不是一件容易的事情，一方面肿瘤患者身体较虚弱，从骨髓取造血干细胞损伤大，有一定的困难；另一方面，患者化疗后，经GM-CSF刺激动员后的外周血中，造血干细胞的数量并不是很多，患者的年龄、自身伴随疾病等会影响外周血动员的效果，若患者年龄大于65岁或是伴随有糖代谢障碍疾病等则动员外周血失败的可能性更大，即动员后患者外周血中CD34+HSCs的含量达不到2×106/kg，而身体状况较好的患者，动员后外周血干细胞含量可以达到5×106/kg，严重限制了人源化小鼠建立的数量[30-31]。随着造血干细胞培养技术的成熟，在细胞因子的刺激下联合专用培养基，造血干细胞可以在体外扩增数倍，但是小鼠免疫系统的重建需要至少一个月，而新鲜的肿瘤组织在小鼠体内移植成功也通常需要2～4个月，整个过程时间较长，花费也较大。

5 展望

Hu-PDX模型不仅可以展现人体肿瘤临床进程，而且给肿瘤的生长提供了与人体相似的微环境，较好的模拟了肿瘤在人体内生长、发展及转移的过程，同时也使研究者可以了解肿瘤对免疫药物的反应，从而促进了肿瘤病理及分子等异质性的保持，为肿瘤的精准靶向治疗提供了更有效的工具[1,3]。重建的模型与患者免疫系统的匹配是Hu-PDX模型的关键问题。采用CD34+HSCs或成熟循环PBMCs的标准方法可能会对人体或小鼠组织造成一些免疫损伤。为了持续研究肿瘤免疫的相互作用，重建的免疫系统必须同时保持对人类供体的耐受性和其新宿主获得的耐受性。虽然，目前已经有研究报道，使用MISTRG小鼠建立的人源化小鼠能够产生具有免疫功能的免疫细胞，但是Hu-PDX模型的建立还面临着较长的道路，需要我们不断探索[22-23]。