郭 丹，王泽英，张 鹏

（1.辽宁省畜牧科学研究院，辽宁 辽阳 111000；2.沈阳农业大学，辽宁 沈阳 110866）

雌激素能刺激雌性动物的副性腺和生殖道，引起第二性征的发育以及性周期的变化，协同促卵泡生成素（Follicle stimulating hormone，FSH）和促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）作用，能使卵泡产生FSH、LH受体[1]。由于雌激素的作用必须通过雌激素受体介导，因此ESR的生物学作用与雌激素的生物学作用密切相关[2]。雌激素受体（ESR）的E区是雌激素与受体的结合区，能影响雌激素基因在雌性动物组织的表达与调控，从而对繁殖周期中卵泡的生长发育发挥作用[3]。因此，选择辽宁绒山羊ESR基因位于E区的外显子4进行研究，有助于直接了解多羔基因的分子机理，找到多羔基因的特异分子标记。

1 试验材料

1.1试验动物试验所需的组织样和血样取自辽宁省畜牧科学研究院提供的辽宁绒山羊。采集10只种母羊的血液保存于加入ACD的血液抗凝管中，存于-70℃冰箱中保存，用于DNA的抽提。

1.2试验药品DL 2000 DNA Marker：购自大连宝生物工程有限公司；血液DNA提取试剂盒：购自天根生化科技有限公司；PCR试剂2×Taq PCR MasterMix：购自天根生化科技有限公司。

1.3主要仪器设备超低温冰箱：NUAIR公司；TC-512型梯度PCR仪：英国TECHNE公司；ChemiDoc XRS数码凝胶成像与分析系统：Bio-Rad公司；OYYHZI型、DYY-111-6B型稳压稳流电泳仪:北京六一仪器厂；U-1800紫外分光光度计：HITACHI公司。

2 试验方法

2.1血液组织DNA的提取室温解冻血样，约10 min，取250 μL血样，利用DNA提取试剂盒进行全血DNA的提取。

2.2 DNA浓度和纯度的检测取2 μL待检DNA溶液和1 μL 6×loading buffer上样缓冲液混匀，上样于1.5%的琼脂糖凝胶中，120 V电压电泳30 min。在凝胶成像仪中观察电泳结果，并拍照保存，以供分析。

2.3引物设计在NCBI数据库找到羊ESR基因序列（登录号为cte-mir-279 MI0010083），利用Primer 5.0引物设计软件，再用软件Oligo 6进行引物评估，对3′-UTR设计特异引物，由上海生工合成引物。依据引物设计原则，进行PCR对羊的ESR基因所用引物如表1所示。

2.4基因目的片段的扩增本试验采用设计的上、下游特异引物，在最适退火温度条件下获得ESR基因各个区段目的片段。用ESR基因的3′-UTR区域的基因引物进行基因扩增时，需要对组织样提取的DNA分别进行扩增。然后根据PCR方法，将检测后成功获得的ESR基因的3′-UTR区域基因扩增产物按1:1比例混匀，将所有成功获得的ESR基因扩增产物进行测序[4]。测序结果显示，3′-UTR区648 bp处有差异。

表1 ESR基因3′调控区目的片段PCR扩增引物Table 1 PCR productsPrimers for 3′control region of ESR

2.4.1 配置25 μL体系反应液2×Taq PCR Master-Mix 2.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，DNA模板1 μL。

2.4.2 PCR反应程序95℃3 min，95℃30 s和54.2℃30 s 30个循环，72℃2 min，72℃5 min。

2.5序列测定与S N P（单核苷酸突变）定位扩增产物用琼脂糖凝胶电泳法检测，取5 μL扩增产物与1 μL加样缓冲液混匀，点样后进行凝胶试验（1.5%琼脂糖凝胶），同时加5 μL Marker作参照，在120 V电压条件下，电泳30 min左右。电泳结束后，凝胶成像仪检测目的条带后拍照，标记，送样到沈阳生工测序。测序的结果用DNAMAN 4.0生物软件进行拼接，进而得到最终目的序列。将目的序列与GenBank中相应基因序列进行比对分析，从而实现基因的序列结构确定[5]。然后利用DNAStar、DNAMAN 4.0、BLAST等软件与GenBank中序列进行比较分析。

利用数据库和线软件预测3′端非翻译区序列靶标MicroRNA： ①miRBase（http://www.mirbase.org/）MicroRNA预测。②Online microRNA predection tool（http://132.77.150.113/pubs/mir07/mir07_prediction.html）。 ③ RNAhybrid（http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html）MicroRNA结构分析。

3 结果与分析

3.1 E S R基因P C R扩增产物普通琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

3.2筛选得到的mi- R N A的特点测序后通过基因序列与波峰的比对发现，在ESR基因3′-UTR区发现了1个差异位点，648 bp位点A/T的突变。见图2和图3。

3.3microRNA的分离与靶标结合的特点利用在线软件查找羊的microRNA，羊的靶标microRNA库包含137个microRNA，用miRBASE软件将ESR基因与羊的microRNA结合情况分析后发现2个突变前结合的microRNA，2个突变后结合的microRNA。

3.3.1 突变前结合的microRNA cte-miR-278 MIMAT0009538， 通 过 Online microRNA prediction tool在线软件查到其序列为UCGGUGGGACUUUCGUUCGUUC，通过DNAMAN 4.0生物软件进行序列比对，得出图4。

图1 辽宁绒山羊梯度PCR电泳Fig.1 Liaoning cashmere goat gradient PCR electrophoresis

图2 辽宁绒山羊ESR基因A/T突变前序列Fig.2 Liaoning cashmere goat ESR gene A/T pre-mutation sequence

图3 辽宁绒山羊ESR基因A/T突变后序列Fig.3 Liaoning cashmere goat ESR gene A/T mutation sequence

图4 辽宁绒山羊突变前序列与cte-miR-278序列比对Fig.4 Liaoning cashmere goat mutagenesis sequence alignment with cte-miR-278 sequence

cte-miR-279 MIMAT0009539，通过Online mi-croRNA prediction tool在线软件查到其序列为UGACUAGAUCCACACUCAUCC，通过DNAMAN 4.0生物软件进行序列比对，得出图5。

3.3.2 突变后结合的microRNA cte-miR-1992 MIMAT0009700， 通 过 Online microRNA prediction tool在线软件查到其序列为UCAGCAGUUGUACCACUGAUGUG，通过DNAMAN 4.0生物软件进行序列比对，得出图6。

图5 辽宁绒山羊突变前序列与cte-miR-279序列比对Fig.5 Liaoning cashmere goat mutagenesis sequence and cte-miR-279 sequence alignment

图6 辽宁绒山羊突变后序列与bta-miR-2355-5p序列比对Fig.6 Alignment of bt-miR-2355-5p sequence with Liaoning cashmere goat

cte-miR-1993 MIMAT0009701， 通 过 Online microRNA prediction tool在线软件查到其序列为UAUUAUGCUGAUAUUCACGAGA，通过DNAMAN 4.0生物软件进行序列比对，得出图7。

使用BiBiServ分析microRNA二级结构，ctemiR-12序列为UGAGUAUUACAUCAGGUACUGA，且长度为22 bp，其靶标前体长度为47 bp，mfe值为-22.9 kcal/mol。见图8。

4 讨论

图7 辽宁绒山羊突变后序列与bta-miR-2461-3p序列比对Fig.7 Alignment of bt-miR-2461-3p sequence with Liaoning cashmere goat mutants

microRNA是一类长度约22 nt的内源性非编码小RNA分子，它能够通过与靶基因3′非翻译区结合从而抑制靶基因的翻译或降解靶基因。microRNA参与复杂的生物学过程[6]。microRNA是一组不编码蛋白质自身不具备开放阅读框架的短序列RNA，在真核生物中广泛存在，在进化上具有高度保守性，表达上具备严格的时空性和组织特异性，且在不同生物体间行使相同的功能。microRNAs在羊绒生长发育中发挥重要的调节作用。随着对microRNA的深入研究，已从识别microRNA，阐明作用机制，转移到鉴定其功能。本试验试图通过生物信息分析ESR基因3′UTR区的相关功能性SNP来筛选不同的microRNA，研究证明，用MicroInspector软件将靶标基因与山羊的microRNA结合情况分析后发现靶标基因的3′-UTR不发生结合情况。发生突变后结合的ctemiR-278，648 bp位点C到G的突变。分析microRNA二级结构，cte-miR-278序列为ACUGCAGUGAAGGCACUUGUAGCA，且长度为24 bp，mfe值为-22.90 kcal/mol这也意味着，预测得到的潜在靶microRNA即cte-miR-278具有相当稳定且重要的意义，可能参与ESR基因的表达调控。

图8 cte-miR-12结构的特征Fig.8 Characteristics of cte-miR-12 structure

5 小结

5.1 辽宁绒山羊群体中ESR基因存在T-305C突变位点，该位点在辽宁绒山羊群体中处于中多态。

5.2 cte-miR-12有可能调控ESR基因参与辽宁绒山羊产羔数的影响。

5.3 本文通过对ESR基因的3′UTR区突变前后与microRNA的结合情况进行分析，筛选出相关microRNA，旨在为今后羊的多态性的研究提供科学的理论依据。

[1]徐子清，梅书棋，樊俊华.猪ES R基因一个外显子片段的克隆与序列分析[J].畜牧兽医学报，2001，32（2）：101-107.

[2]黄朝辉，王金福.一种新型的雌激素受体[J].生命科学，2000，12，（3）：126-129.

[3]Watanabe T,Hayashi Y,SembaRetal.Bovine Mitochondrial DNA polymorphism inrestriction enon ucleasecl eava gepatterns and the location of the polymorphic sites[J].Biochemieal Genetics,1985,23(11/12):947-957.

[4]Taberlet P,Mattock H,Dubois-Paganon Cetal.Sexing free-ranging brown bears Ursusarctos using hairs found in the field[J].Molecular Ecology,1993,2(6):399-404.

[5]Wilson A C.Mitochondrial DNA and two perspectives onevolution arygenetics[J].BioLJ.Linn.Soc.,1985,26(5):375-378.

[6]郭丹，曹悦.辽宁绒山羊现代生物技术研究进展[J].现代畜牧兽医，2012，9：35-37.