王 欢，刘 茜，李 红，杨晓华，尹 娜，杨 静，李 媛，潘兴华，魏 玲

Klotho基因是1997年Kuro等[1]研究自发性高血压大鼠时偶然发现的新型抗衰老基因，敲除Klotho基因的小鼠会过早出现与衰老相关的表型，如皮肤萎缩、肺气肿、糖代谢异常、骨质疏松等，甚至导致寿命缩短。Semba等[2]研究发现，血浆中Klotho高表达是社区成年居民较少发生心血管疾病，如冠状动脉疾病、心力衰竭、外周动脉疾病的独立保护因素。本实验拟研究慢性心衰大鼠心肌Klotho基因表达，及其与心肌Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达的相关性，探讨其抗心肌纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠20只，由昆明医科大学动物实验中心提供[许可证号：SCXK（滇）2011-0005]，鼠龄约 3 月龄，体重约（300±30）g，其中10只大鼠用于心衰大鼠模型制备,10只为正常对照组。

1.2 实验材料 胎牛血清（BI公司），胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio公司），慢病毒载体LV-EGFP（上海吉凯生物有限公司），盐酸异丙肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司)，Masson染色试剂盒（武汉谷歌生物科技有限公司），DMEM-F12培养基（HyClone公司）。

1.3 心衰模型的建立及实验分组 20只SD大鼠经过适应性喂养1 w后，随机分成正常对照组与心衰模型组，心衰模型组大鼠连续腹腔给予异丙肾上腺素注射，3 mg/(kg·d)，共 14 d。 建模 2 w 后行超声心动图测定，左心室射血分数＜50%的大鼠定义为慢性心衰大鼠。动物实验方案均由医院伦理委员会批准。

1.4 检测指标

1.4.1 心/体重指数 称取各组建模或喂养2 w后大鼠体重，麻醉后，剪开胸腔，取出心脏，用冰生理盐水洗涤血污，剔除脂肪、血管等非心肌组织后，无菌纱布吸干心脏表面液体，称取心脏重量，计算心脏湿重/体重指数（HW/BW）。

1.4.2 心肌组织中 Klotho、CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA的表达量 采取大鼠心肌组织,用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测。根据RNAiso Plus使用说明书的操作步骤提取总RNA，使总RNA浓度在 3～5 μg/μl，A260/A280 比值在 1.8～2.0。 取 2 μg总RNA，按照GoScriptTM Reverse Transcription System Kit说明书配制20 μl逆转录系统，所得产物cDNA置于-20℃保存。实时荧光定量PCR仪扩增大鼠 Klotho、ColⅠ、Collagen Ⅲ，循环条件：预变性95℃10 min，再一步变性95℃、15 s，退火延伸60℃、60 s，共40个循环。PCR结束后，根据每个样本反应后达到荧光信号阈值的循环数（Ct值），计算2-△△Ct值，对比分析两组Klotho、CollagenⅠ、CollagenⅢ基因的mRNA表达差异。 引物见表1。

1.5 统计学方法 应用SPSS18.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，心重/体重指数采用单因素方差分析，多个样本均数间的两两比较采用LSD-t检验；两变量相关性分析采用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 Klotho、CollagenIa1、CollagenⅢa1PCR扩增引物序列

2 结果

2.1 两组心重/体重指数及心功能检测结果 建模或喂养2 w后，心衰模型组的心重/体重指数为（6.01±0.30）%，明显高于正常对照组（4.12±0.25）%(P＜0.01)。超声心动图结果显示：心衰模型组大鼠的射血分数（EF）为（39.53±2.55）%，显著低于正常对照组的（70.66 4.08）%（P＜ 0.01）。

2.2 两组心肌 Klotho和 Collagen I、CollagenⅢmRNA表达量比较 RT-PCR检测结果显示，两组心 肌 组 织 中 Klotho、Collagen I和 CollagenⅢmRNA均有表达。心衰模型组的Klotho较正常组显著降低（P＜ 0.05），而 CollagenⅠ和 CollagenⅢ的mRNA相对表达量较正常对照组显著增加（P＜0.05）。 见表 2。

2.3 各指标间相关性分析结果 Pearson相关分析结果显示，心肌Klotho mRNA与CollagenⅠmRNA和CollagenⅢ mRNA表达量均呈负相关（r=－0.578、0.558，P＜ 0.05）。

3 讨论

表2 两组心肌KIotho和CoIIagenⅠ、CoIIagenⅢmRNA表达量比较

心肌纤维化是心脏重构的重要病理基础，心肌胶原的沉积是心肌纤维化的主要病理基础[3]。近年来众多研究证实，Klotho基因能抑制心肌纤维化及心肌细胞凋亡，改善心肌重构[4-5]。Xie等[6]研究发现，Klotho蛋白通过抑制瞬时受体电位通道-6（TRPC-6)，阻滞了Klotho基因缺陷小鼠心肌病理性重构及纤维化的发生。Zhang等[7]研究表明，Klotho蛋白主要通过阻滞胰岛素生长因子(IGF1)/磷脂酰肌醇-3-羟激酶（PI3K）信号通路介导的离子通道胞吐作用，降低细胞膜上TRPC6的含量，发挥心脏保护作用。有研究表明[8]，血循环中的Klotho能维持血管内皮完整性，保护血管通透性。但Klotho基因改善心肌纤维化的机制仍不甚清楚。

本研究在既往研究的基础上，进一步应用RT-qPCR法研究慢性心衰大鼠心肌中Klotho基因与心肌CollagenⅠmRNA和CollagenⅢmRNA表达的相关性。结果表明，心衰大鼠的心肌Klotho mRNA的表达量较正常对照组显著降低（P＜0.05），而Collagen I和CollagenⅢmRNA的表达量较正常对照组显著增加（P＜0.05），说明心衰导致了心肌细胞的抗衰老功能减低，而纤维化倾向增加。进一步相关分析显示，心衰大鼠心肌Klotho mRNA表达量与心肌CollagenⅠmRNA和CollagenⅢmRNA的表达量均呈负相关，提示 Klotho和 CollagenⅠ、CollagenⅢ之间可能存在相互调节关系，这可能是Klotho基因抑制心肌纤维化的机制。

[1] Kuro M,Matsumura Y,Aizawa H,et al.Mutation of the mouse Klotho gene leads to a syndrome resembling ageing [J].Nature,1997,390(6655):45-51.

[2] Semba RD,Cappola AR,Sun K,et al.Plasma klotho and cardiovascular disease in adults[J].Am Geriatr Soc,2011,59(9):1596-1601.

[3] Hu SS,Kong LZ,Gao RL,et al.Outline of the report on cardiovascular disease in China [J].Biomed Environ Sci,2012,25(3):251-256.

[4] Li X,Han J,Li L,et al.Effect of farnesyltransferase inhibition on cardiac remodeling in spontaneously hypertensive rats[J].International Journal of Cardiology,2013,168(4):3340-3347.

[5] 贾政，魏玲，刘茜,等.重组腺病毒介导Klotho基因转导对大鼠心力衰竭心肌重构的影响[J].中华心血管病杂志,2015,43(3):219-226.

[6] 张军，代文静，周敬群.抗衰老Klotho蛋白减轻大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤[J]，中国病理生理杂志,2015,21(6):980-987.

[7] Zhang W,Xue D,Hu D,et al.Secreted klotho protein attenuates oeseogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal Stem cells in vitro via inactivation the FGFR1/ERK signaling pathway[J].Growth Factors,2015,33(5-6):356-365.

[8] Kusaba T,Okigaki M,Matui A,et al.Klotho is associated with VEGF receptor-2 and the transient receptor potential canonical-1 Ca2+channel to maintain endothelial integrity[J].Proc Nat Acad Sci,2010,107(45):19308-19313.