陈薛，师长宏,2*

(1. 成都医学院基础医学院，成都　610500； 2. 第四军医大学实验动物中心，西安　710032)

前列腺癌作为男性泌尿生殖系统重要的恶性肿瘤，其发病率呈显著增长的趋势。虽然近年来有关前列腺癌的研究逐步深入，但仍缺乏能够准确概括疾病发生发展并高效转化入临床研究的动物模型。

目前已报道的前列腺癌动物模型主要有基因工程小鼠模型(genetically engineered mouse，GEM)、细胞系异种移植模型(cell line derived xenograft， CDX)和人源性异种移植模型(patient-derived xenograft，PDX)，这些模型各具有各自的优缺点和应用范围。GEM是研究前列腺癌发生发展过程中单一或多个基因作用的有效模型[1]，包括小鼠前列腺转基因腺癌模型(transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate，TRAMP)[2]以及pten和p53联合缺失小鼠等[3]。此类模型成本高，且模型所表现出的雄激素依赖性可能与临床无关或小鼠自身不存在前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)等问题，使其在药物开发及评价的应用受限[4-5]。据现有文献报道，PC3、LNCaP和DU145细胞系是用于建立前列腺癌CDX模型的常用细胞系，稳定成瘤的仅有PC3细胞系，但这种模型不能重现临床前列腺癌的多种异质性，不能代表癌细胞与其基质成分之间的相互作用，不够充分预测临床药物治疗反应及效果。在一项使用CDX模型检测新型抗雄激素MDV-3100的研究中，药物在LNCaP细胞系所建立的CDX模型中的反应率达到92%，但在临床上，MDV-3100的反应率仅有不足50%[6]。近年来，人们尝试将前列腺癌病人新鲜的瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内建立PDX模型较好的保持了原发瘤的组织形态特征。但由于大部分前列腺癌的发生与激素密切相关，造成原发性前列腺癌移植小鼠后成功率较低，阻碍了PDX模型的应用[7-9]。本文重点介绍了前列腺癌PDX模型建立方法的研究进展及其在个体化治疗研究中的应用。

1　影响模型建立的因素

1.1　体内雄激素水平

雄激素的刺激与前列腺组织的生长密切相关，体内雄激素的水平很大程度上决定了建模的成败，而雄激素以睾丸分泌的睾酮为主。正常男性血清睾酮水平范围为14～25.4 nmol/L，但正常免疫缺陷小鼠血清睾酮水平均数明显低于此值，且波动范围较大，无法模拟正常男性血清睾酮水平。因此，建立前列腺癌PDX模型需要补充外源性雄激素[10-11]。另有研究表明，雄激素对前列腺细胞或组织的生长发育具有双向作用[12-13]。汪涌等[14]在LNCaP细胞培养液中加入不同剂量的人工合成雄激素R1881，发现其在10-9mol/L及以上浓度时抑制LNCaP细胞生长，相反，在10-10mol/L及以下浓度刺激细胞生长。程尚等[13]通过在前列腺癌荷瘤小鼠皮下包埋不同剂量睾酮，也证实了高剂量(20 mg)及低剂量(5 mg)补充对前列腺癌的生长起不同作用。小鼠在去势状态下皮下包埋适当剂量的雄激素能模拟前列腺癌患者的血清睾酮水平，且成瘤率高达90%[13,15]。越来越多的研究者在建立前列腺癌PDX模型时为小鼠补充一定剂量的外源性雄激素，以促进前列腺癌细胞的生长发育和疾病进程，从而提高前列腺癌PDX模型的成功率[16-17]。

1.2　原始肿瘤组织的特征

成功建立前列腺癌PDX模型需要高质量的新鲜肿瘤组织[17]，并及时将其接种于小鼠体内，以确保肿瘤组织存活及其活力。肿瘤组织离体后处于缺血缺氧状态，而这种缺血性损伤会对组织细胞的生长发育能力产生负面影响，进而影响肿瘤组织的移植成功率。Young等[18]在一项胃癌PDX模型的研究中发现减少肿瘤组织离体时间和总移植时间与移植成功率呈正相关(P=0.003和P=0.01)。也有人使用切片机将瘤组织切割成约300 μm厚度，以便氧气及营养物质最大限度地扩散到PDX中[19]。精确修剪用于移植的前列腺癌组织，去除电刀灼伤等机械损伤部位的同时，应注意保留移植组织中恶性病灶[20-21]，肿瘤癌细胞数量大于50%且细胞Ki67表达阳性也可以提高前列腺癌PDX模型的成功率[17]。另外瘤组织中TMPRSS2-ERG融合基因、肿瘤分期以及前列腺特异性抗原(PSA)、雄激素受体(androgen receptor，AR)水平等均是影响PDX模型成功的因素。TMPRSS2-ERG融合基因在前列腺癌中发生率很高，几乎一半的患者中都存在这种基因融合，是发生最为频繁的基因变异，TMPRSS2-ERG融合基因的发生与ERG蛋白的表达有关[22-25]， ERG蛋白表达率高则前列腺癌多为低分化期，其恶性程度高[26-28]，移植裸鼠PDX模型成功率较高。也有研究认为，血清PSA水平短期内快速上升，提示疾病处于进展期，肿瘤组织恶性程度较高[17]；而AR表达与前列腺癌病理分期呈负相关[29-30]，其在雄激素依赖型前列腺癌向去势抵抗性发展的过程中起关键作用，特别是AR剪接变体—AR-V7可以作为晚期前列腺癌潜在的预测性肿瘤标志物[31]，因此，肿瘤组织中PSA、AR阳性率对移植成功率有一定的影响。综上所述，使用晚期或进展期前列腺癌患者的标本，去除物理损伤，选用高质量的肿瘤组织及时接种至免疫缺陷小鼠可以提高PDX模型的成功率。

1.3　肿瘤基质环境和间质重组

人前列腺肿瘤组织移植到在小鼠体内生长需要数月不等，生长缓慢且通常成活率极低。这是多因素相互作用的结果，特别是基质微环境，包括免疫细胞、成纤维细胞、细胞外基质和脉管系统等在前列腺肿瘤发生中的缺失。因此，为了重现基质微环境的作用，许多实验室将人前列腺癌组织与新生鼠精囊间质混合，然后共移植入小鼠体内。结果显示，采用这种方法为移植物提供了一个较为理想的微环境生态位，前列腺癌组织生长活跃，获得了良好的成瘤效果，且维持了人类肿瘤组织的重要特性[32-35]。另外，也有人将瘤组织中混入基质胶(Matrigel)或层粘连蛋白，也获得了较高的成功率[36]，相似的结果在其他类型肿瘤PDX模型中也有报道[37-38]。

1.4　其他因素

已证实移植所用小鼠的免疫缺陷越高，则移植成功率会有相应提升[39-42]。早期前列腺癌PDX研究常使用雄性裸鼠，其成瘤率较低；随后，人们使用免疫缺陷程度更高的SCID小鼠，或者是NOG小鼠和B-NDG小鼠[42-43]。此外，关于前列腺癌组织移植位点，皮下移植成功率较低，通常不足10%[15, 44]；肾包膜下血管化丰富，具有良好的组织液压力和淋巴流量，利于前列腺癌组织的生长，建模成功率最高可达93.4%[19,45-47]。影响前列腺癌PDX模型成功率的许多因素尚未明确，如何提高成瘤率亟待解决。因此，进一步验证并深入了解这些影响因素将有利于我们探索前列腺癌的发生发展，从而改善临床患者的治疗效果。

2　PDX模型的评估和应用

PDX模型是否成功建立，首先是保证移植瘤组织存活，且冻存之后能够再次在小鼠体内复苏并稳定传代。必须对传代的移植瘤进行多项检测，确认是否能够重现前列腺癌疾病的多样性，从而确认与人类原发肿瘤的一致性。

2.1　一致性分析

通过H&E染色比较原发瘤与移植瘤之间组织形态学差异是检测前列腺癌PDX模型溯源性的重要方法。前列腺癌病理类型中腺癌最为常见(>95%)，其组织结构通常表现为异形核、结构异常以及局部浸润，例如正常腺泡结构变形或消失，出现单层上皮细胞、蓝色粘蛋白、筛状结构或实性巢状/条索状结构等[48]。同时需对原发瘤和移植瘤进行免疫组织化学染色，利用抗原抗体反应，检测相关抗原的分布和表达情况，确保其一致性。前列腺癌组织中最常检测的抗原有PSA、p63、34βE12、CK5/14/18、AMACR、P504S等。PSA在大多数前列腺癌中都会有所升高，它常作为衡量患者病情进展与患者生存期的预测因子，与Gleason分级、肿瘤分期一起决定患者的临床治疗方案[49-51]。因此，PSA常作为评价前列腺癌PDX模型保真度的检验指标之一。最近，研究人员对其所建立的异种移植物进行分析，结果表明这些模型重现了临床前列腺癌患者中常见的疾病变异性和异质性，包括前列腺癌激素依赖型向非依赖型的转分化以及人类疾病表型中最常见的基因组改变：TMPRSS2-ERG重排和AR扩增等；也有一些异种移植物在AR配体结构域中表现出了mCRPC中常见的AR突变[52-53]。大量的分析结果显示PDX模型可以保留原发瘤的主要特征，特别是有一部分PDX模型能够基本模拟人类前列腺癌进程。此外，研究发现p63、AMACR、P504S等一系列前列腺癌标记物，都能够与PSA检验相结合，将良恶性前列腺组织区分开来，成为验证PDX模型与相应患者肿瘤组织一致性的标准[54]。另外，检测血清游离PSA和总PSA并计算二者比值，能够提高前列腺肿瘤筛查和诊断的特异性。

工信部原材料司处长张文明表示：“我们国家在继续实施扶持国产钾肥发展的优惠政策，保障国产钾肥竞争力和提升自给率的同时也要加快境外钾肥基地建设，实现双轮驱动，巩固国内价格洼地，从国家层面顶层设计，引导企业有序推进‘走出去’步伐。对境外钾肥基地加大支持力度，形成双翼协同保障我国钾肥的稳定供应，提升我国在国际钾肥市场的话语权。”由于各方面条件限制，建设一个大型钾盐生产企业从勘探、设计、建设到出成品至少需要5-7年的时间，建设周期漫长且投资巨大。据了解，目前我国在境外已进入生产运营阶段的企业只有在老挝的中农集团和开元集团，它们是我国“走出去”找钾和采钾的企业佼佼者。

2.2　治疗药物的筛选

治疗前列腺癌的药物主要分为激素类药物和化学药物。在PDX模型上进行疗效观察，能够为个体临床患者治疗提供重要参考。

2.2.1激素类药物

前列腺癌的发病与雄激素有关，激素类药物治疗是晚期雄激素依赖型前列腺癌最重要的治疗手段。其中，比卡鲁胺具有较好的临床效益，是临床治疗前列腺肿瘤最常用的激素类药物之一[55-57]。且在前列腺癌PDX模型的药物研究中，比卡鲁胺同样显示了延缓体内肿瘤生长，延长荷瘤小鼠存活期的效果，并可以有效降低血清PSA水平[58-59]。另外一种较为常用的药物——地盖瑞利，可在用药后快速降低雄激素水平，无睾酮一过性升高现象，且可降低PSA进展的风险。Charlotte等[59]建立了激素依赖性的前列腺癌PDX模型PAC120，使用地盖瑞利和其他三种药物单独或联合处理，结果显示，地盖瑞利与曲妥珠单抗联合治疗能够有效抑制肿瘤生长，并且几乎完全避免了激素逃逸现象的发生，而单独的曲妥珠单抗治疗并没有效果。

2.2.2常规化疗药物

这些校企合作的实验室和实习基地的建立，为学生营造了科学实践的环境，扩大了实践的机会，拓展了计算机网络实践的技术领域，推动了产学合作教育向纵深方向的发展。

21世纪以前，尚无研究证实化学疗法能改善前列腺癌患者的生存，其在前列腺癌治疗中主要以改善症状为主。直到2004年Tannock 等[60]使用多西他赛联合泼尼松治疗晚期前列腺癌，结果显示多西他赛能有效延长进展期去势抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)患者生存期，缓解症状。这重新燃起了化学药物治疗前列腺癌的希望，研究者们陆续发起了多个多西他赛治疗前列腺癌的研究。2006年，Yao等[61]研究发现与单独多西他赛或去势治疗组的荷瘤小鼠相比，多西他赛治疗后去势组，表现出最有效的抗肿瘤作用。且经TUNEL测定证实，该组凋亡肿瘤细胞密度明显高于其他治疗组。2008年，Yin 等[62]联合多西他赛与单克隆抗磷脂酰丝氨酸(PS)抗体2aG4(一种血管靶向单克隆抗体)治疗小鼠激素难治性前列腺癌起到了明显的肿瘤抑制作用。其后续实验表明，2aG4增强了多西他赛抗肿瘤生长和抗转移活性的作用，且二者联合治疗的毒副作用较小。2014年，Qu等[63]将多西他赛与具有体外抗前列腺癌活性的多价植物药物Aneustat(OMN54)结合来改善晚期前列腺癌的疗效，数据显示二者之间有显著的协同作用，该组合增强了抗肿瘤活性，且未引起明显的毒性反应。

3　展望

建立高保真的前列腺癌PDX模型是前列腺癌生物学研究和药物治疗的基础。理想的前列腺癌PDX模型不仅应能够维持原发肿瘤中的组织结构、异质性和基质组分，其疾病的进展过程及对药物的反应性也应与临床结果高度相似。但前列腺癌PDX模型的成功率极低，限制了其发展及应用，如何提高成模率成为建立这种模型的关键。为此，科学家们进行了多种尝试，包括补充外源性雄激素、新鲜肿瘤组织与新生鼠精囊间质重组以及“human-in-mouse”模型等[7, 64-65]；为了更精准地模拟人类前列腺癌特性，也有人将人造血干细胞或外周血单核细胞注射于小鼠开发了“human-in-mouse”模型，以在小鼠体内重现人类部分免疫成分，提供前列腺癌生长所需的免疫微环境[66-67]。这在一定程度上解决了小鼠免疫缺陷而无法用于评估抗肿瘤免疫治疗的问题。上述尝试对前列腺癌新药研发和作用机制研究具有重要意义，进一步推进了前列腺癌个体化肿瘤治疗的进程，并促进其研究结果向临床转化。