葛百一 何璨

摘 要 单倍体育种技术可极大地提高玉米育种效率，在玉米育种中应用广泛，但也存在一系列问题。本文对玉米单倍体育种的相关概念进行了阐释，并对秋水仙素处理法和除草剂处理法的相关研究进展进行了综述，重点介绍了秋水仙素处理法中的浸种法、浸根法、浸芽法、针刺生长点法和滴注心叶法优缺点进行了分析，介绍了玉米单倍体加倍的环境影响和内在机理研究进展，为加快我国玉米单倍体育种提供参考。

关键词 玉米 ；单倍体 ；加倍技术

中图分类号 S513

Abstract The Haploid breeding technology could greatly improve the efficiency of maize breeding，it had wide application but also some problems. Some related concepts of Maize Haploid Breeding were explained， the research progress of colchicine treatment and herbicide treatment were summarized， the advantages and disadvantages of seed soaking， root soaking， budding， needle growing point method and heart leaf dripping method of colchicine treatment were analyzed. The environmental impact and internal mechanism of haploid doubling of maize were studied in order to provide reference for accelerating haploid breeding of maize in China.

Key words maize ； haploid ； doubling technique

玉米是世界上最重要的糧食和能源作物，也是中国重要的粮食作物。2017年中国玉米播种面积3 544.52万hm2，总产量21 589.1万t，是中国第一大粮食作物，远远超过了稻谷的3 017.6万hm2和20 856万t。因此，通过提高玉米育种水平进而来提升玉米产量一直是我国重要的研究课题。但是，采用常规方法进行玉米的自交系选育，耗时较长，一般长达4寠6年。采用单倍体育种技术可极大地缩短选育年限，在3季即可获得纯合的自交系，成为现代玉米育种不可或缺的育种手段之一，受到广大育种工作者的极力推崇。笔者在对单倍体植株的相关概念进行解释的基础上，重点对单倍体加倍技术在玉米上的应用进行综述，为推进我国玉米单倍体育种提供参考。

1 单倍体育种相关概念

目前，植物单倍体产生的途径主要有3种方法：一是自然发生单倍体，对玉米来说，自然产生单倍体的频率仅为0.1%[1-2]，远远不能满足玉米育种的需要；二是人工诱导产生单倍体，根据处理方法的不同，单倍体加倍率或雄花可育程度均有显著提高；三是诱导系活体诱导单倍体技术，目前玉米育种中单倍体的诱导方法主要有花药培养、雌配子体培养、物理化学方法，其中，第3种方法因其有效性和经济性成为当前单倍体诱导的主流方法[3-6]。

单倍体鉴定是作物遗传育种的基础，目前鉴定技术包括了形态学、细胞学、解剖学、生理生化和遗传标记鉴定等。

2 玉米单倍体加倍技术

玉米单倍体本身无直接利用价值，也难以获得后代。因此，需要对玉米单倍体进行加倍，使其维持完成的染色体组，进行正常生长并获得纯合的后代，加倍方法主要有自然加倍及人工化学加倍2种。玉米单倍体自然加倍的频率很低，一般低于5%，所以在单倍体育种过程中主要采用人工加倍方法。

2.1 秋水仙素处理法加倍

秋水仙素是目前最为常用的化学加倍试剂，已经应用于各种作物的育种过程中，一般在其溶液中添加二甲基亚砜、吐温、细胞分裂素、甘油等增加其效率。添加二甲基亚砜、甘油等低分子量和中性溶质，能增加溶液粘度，使秋水仙素等缓慢渗透到细胞质内部，减少其生理损伤。常用的方法有浸种法、浸根法、浸芽法、针刺生长点法和滴注心叶法。

浸种法操作较为简单，即直接将玉米单倍体种子置于不同浓度的秋水仙溶液浸泡。影响其加倍效率的除浓度外，还受浸泡时间、程序的影响，一般需要在浸泡前和浸泡后用清水处理一段时间，减少秋水仙素的毒性[7-8]。

浸根法是指用秋水仙素浸泡单倍体根的方法。可在幼芽期和幼苗期进行。将植株从土壤中拔出来后，洗净根部泥土，将其浸泡在秋水仙素溶液中一段时间后，流水洗净根部的药业液后，再将其种植于大田中。但是，该方法耗费的药剂量大，成本较高，同时涉及到育苗、处理、移栽等多个环节，幼苗会受到毒性和移栽损伤的双重影响，因此其成活率较低[9-12]。

浸芽法指用秋水仙素浸泡幼芽的方法，当玉米单倍体幼芽约2 cm时，削掉部分顶端浸泡于秋水仙素溶液一段时间后移栽到育苗盘中，直至4寠5片叶片时移栽到大田。但是，该方法由于整个幼芽均在秋水仙素溶液中，幼芽和幼苗根部均吸收了大量的秋水仙素溶液，缓苗所耗费的时间较长，易于造成大量的幼苗死亡。此外，该方法处理程序比较复杂，相对较为精细[13]。

针刺生长点法是用注射器将适宜浓度的秋水仙素直接注射到植株的生长点处。一般是在玉米单倍体植株在6寠7叶片时在植株茎尖生长点注射秋水仙素溶液。该方法不需要育苗和移栽，可极大地避免因育苗和移栽带来的幼苗死亡，同时，

6寠7叶片时幼苗相对茁壮，缓苗期大大缩短，成活率较高，加倍率也相对较高。但是，优于单倍体幼苗大小不一，很难保证针刺注射时的标准化处理，同时此时植株矮小，操作人员难以长时间完成大量处理[14-16]。

滴注心叶法是将单倍体幼苗移栽于营养皿后，将配比好的秋水仙素溶液滴注于玉米单倍体幼苗的心叶内，缓苗处理后移栽大田进行精细管理。该阶段一般为单倍体植株生长到三叶期和五叶期时。

目前，国内外学者针对秋水仙素用于玉米单倍体加倍的浓度、方法进行了比对研究。慈佳宾等[17]采用不同浓度的秋水仙素分别用浸根法、浸芽法、滴心叶法和针刺生长点法对玉米单倍体加倍效果进行了研究，结果发现，浸根法处理后玉米单倍体植株的成活率、散粉率、结实率都较低；浸芽法处理后成活率可达58.4%寠78.6%，但散粉率较低，仅可达3.1%寠10.8%，结实率仅1.1%寠3.1%；滴心叶法0.4 mg/mL处理后，玉米单倍体植株的成活率、散粉率、结实率分别可达52.2%、28.9%、11.1%；针刺生长点法0.6 mg/mL处理后，玉米单倍体植株的成活率、散粉率、结实率分别可达59.6%、45.9%、15.2%，该方法及剂量最优。

2.2 除草剂加倍法

利用秋水仙素对玉米单倍体进行加倍处理，虽然可极大地提高加倍率，但其毒性较大，易于对单倍体植株和操作人员造成损害。因此，寻找具有秋水仙素功能的替代品成为重要任务。目前，已筛选出一些具有类似功能的抗微管除草剂代替，如氟乐灵、拿草特、甲基胺草磷等。已有研究显示，部分除草剂的加倍效率不但明显高过秋水仙素，还易于降解，不会导致对人体和土地的毒害。慈佳宾等[18-19]采用氟乐灵、拿草特2种抗微管除草剂为试验材料，以秋水仙素为对照，在不同部位、不同处理时间和不同浓度条件下对玉米单倍体的加倍效果进行了研究，结果发现，采用浸种法进行处理时，氟乐灵浓度为80μmol/L处理20 h其加倍率最高可达到35.7%；采用浸芽法进行处理时，拿草特浓度为60μmol/L处理24 h其加倍率最高可达24.8%；采用浸根法进行处理时，氟乐灵浓度为40μmol/L处理15 h其加倍率最高可达到16.8%。惠国强等[10]采用甲基胺草磷、炔苯酰草胺、氟乐灵等3种除草剂分别对先玉335、中农大4号、8607暳8609等3种单倍体植株进行加倍，结果显示，甲基胺草磷在80 μmol/L对先玉335、中农大4号、8607暳8609的加倍率最高，分别达到26.32%、22.02%、19.40%；炔苯酰草胺在80 μmol/L对先玉335、中农大4号、8607暳8609的加倍率最高，分别达到20.81%、18.06%、17.50%；氟樂灵在40 μmol/L对先玉335、中农大4号、8607暳8609的加倍率最高，分别达到17.61%、15.22%、14.05%。

2.3 玉米单倍体加倍的环境影响

在长期的研究过程中，众多学者发现，对于来源于同一基础材料的玉米单倍体，采用同一方法、同一浓度、同一管理模式的方法进行加倍处理后，不同地域种植的玉米单倍体的加倍率差异显著，推测不同种植环境对玉米单倍体加倍具有重要影响。段民孝等[20]于2010年在北京昌平（春季）、北京顺义（春季）、甘肃张掖（春季）、海南南滨基地（冬季）、海南梅西基地（冬季）针对来源于WLIPT的玉米单倍体加倍情况进行分析，结果显示，在采用同样方法、同样管理模式下，甘肃张掖春季播种的效果最佳，授粉率和结实株率分别达到19.69%和7.43%。姜龙等[21]研究结果显示，海南冬季进行单倍体诱导，其加倍效率显著高于北京和长春等地。

2.4 玉米单倍体加倍的遗传背景影响

已有的系列研究显示，玉米单倍体加倍效率除与加倍诱导剂、加倍方法、环境因素密切相关外，还与基础材料的基因型有较大关联。丁照华[22]等研究发现，不同基因型基础材料间单倍体诱导率差异显著，其诱导效率与基础材料的基因型有一定关联；相同杂交模式的基础材料间诱导率变化也较大， 杂交模式间诱导率均值差异不显著；具有相同亲本的基础材料诱导率变化较大，组间差异不显著。诱导率大小受基因互作等多因素影响。

2.5 玉米单倍体加倍机理

长期以来，科学家们对单倍体植株的加倍机理进行了长期研究，目前认为其加倍机理可从2个方面来进行解释。

2.5.1 干扰玉米单倍体的纺锤体形成

目前染色体加倍使用的化学药剂主要有秋水仙素和部分除草剂。秋水仙素诱导加倍的机制与微管、着丝粒的结构和特性有关，秋水仙素可与β微管蛋白肽链中第201位的半胱氨酸结合，导致原有的α微管与β微管进行解聚，进而干扰微管中α微管与β微管的正常聚合，进而破坏了纺锤体形成，终止了细胞分裂，不能一分为二，最终生成了双倍染色体数目的细胞。

2.5.2 倍性效应基因表达调控

单倍体植株经加倍处理后，受微管蛋白解聚等影响，大量基因出现了差异化表达和甲基化修饰，部分基因表现为被激活或沉默。张红宇等[23]对水稻的单倍体植株和双倍体植株进行了全基因组甲基化位点监测，发现被激活变化和沉默变化的占据了基因组表达的0.61%。Stupar等[24]研究发现，水稻叶鞘和根尖组织中有10%的基因表达位点发生变化。

3 结语

玉米单倍体加倍技术虽然经过多年的发展，相关成果也有了很大的积累。但总体而言，研究并不深入，绝大部分是针对某一品类玉米采用不同方法、不同加倍试剂的检测，总体而言较为粗陋，可视为经验数据。对于环境因素的研究也过于简陋和宏观，并未从温度、湿度、降雨、地力等方面进行细致化试验。同时，在加倍机理方面，研究也相对较小，目前相关研究多集中在水稻和拟南芥等试验材料上，对于不同加倍方法的细致化机理研究不够深入，尤其是对除草剂对单倍体加倍的内在机制、不同滴注位置的加倍机理表达未进行细致研究。最为重要的是，尚未形成固定的标准化流程，导致在大规模育种过程中稳定性不足，后续应对其进行深入研究。

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