李志芹，卢 艳，贾国荣

（内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头 014010）

DNA甲基化修饰异常在白血病发生过程中是一个早期、普遍现象，是其重要发病机制之一[1-2]。大量的研究资料表明[1-2]，在白血病患者中可发现多种抑癌基因DNA异常甲基化而表达沉默，并且发生异常甲基化的抑癌基因种类在不同白血病类型有一定的差别。本研究检测急性白血病的基因甲基化情况，为急性白血病的诊断及治疗提供实验室支持。

1 病例与方法

1.1 病例

自2015年1月～2016年12月在包头医学院第一附属医院血液科住院的急性白血病患者共50例，诊断标准参照2008年WHO标准。其中男21例，女29例，年龄18～65，中位年龄39。对照组为我院健康体检患者的外周血标本。本研究得到医学伦理委员会的批准，受试者均知情同意。

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒：京天根生化科技有限公司，甲基化试剂盒：京智杰方远科技有限公司，甲基化特异性PCR试剂盒：根生化科技有限公司，DNA甲基化引物合成：海生工有限公司。

1.3 标本采集及制备

采集急性白血病患者诊断时的骨髓液5mL，用Ficol液进行细胞分离后放入-80℃冰箱中冻存。应用DNA提取试剂盒进行DNA提取，甲基化试剂盒进行甲基化，甲基化特异性PCR试剂盒进行PCR扩增。引物为DKK3甲基化引物，序列上游：CGGTTTTTTTTCGTTTTCGGG序列下游：CAAACCGCTACATCTCCGCT，DAPK甲基化引物序列上游：GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC 序列下游：CCCTCCCAAACGCCGA，CDKN2A甲基化引物：序列上游TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3，序列下游：5-CCACCTAAATCGACCTCCGACCG-3；

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对实验数据进行分析，计数资料以百分数（%），例（n）表示，采用x2检验，计量资料以“±s”表示，采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

（1）急性白血病患者骨髓液中DKK3、DAPK、CDKN2A甲基化表达：此三种基因甲基化均在急性白血病患者骨髓液中表达。而对照组中均未发现基因的甲基化表达。见表1。

（2）急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病患者均有基因甲基化的表达，急性髓系白血病的基因甲基化表达水平更高。

表1 急性白血病患者及对照组DKK3、DAPK、CDKN2A基因甲基化表达的比较

3 讨 论

Dkk3作为一种抑癌基因，其失活或缺失可能促进多种肿瘤的发生、发展以及转移。在慢性淋巴细胞白血病及骨髓增生异常综合征中发现DKK基因表达下降及甲基化异常，本研究发现在急性白血病患者中DKK3基因甲基化率为70%，其中急性髓系白血病表达率为76%，而急性淋巴细胞白血病表达率为44%。

细胞周期依赖性激酶抑制基因（ cyclin dependent kinase inhibitor，CDKN2A ）是一种多肿瘤抑制基因。KisatoNosaka等人的研究发现在急性成人T细胞白血病（ATL）中，CDKN2A基因甲基化率为47%，淋巴瘤型成人T细胞白血病甲基化率为73%。我们检测到急性白血病患者CDKN2A基因甲基化率为56%，急性髓系白血病甲基化率为61%，显示CDKN2A基因甲基化可能是急性白血病的发病机制之一。

死亡相关蛋白激酶（death—associated protein kinase 1，DAPK1）是调控细胞增殖与死亡的基因。我们检测到急性白血病患者DAPK基因甲基化率为56%，此结果与国内李俊华[3]等的研究结果接近。

通过我们的研究发现，急性白血病患者DKK3，DAPK，CDKN2A基因甲基化均高表达，说明基因甲基化在急性白血病患者中高表达可能是一种普遍现象，基因甲基化可能会在急性白血病的诊断和疗效监测方面提供新的方法。

[1] Vanesa Martin;XabierAgirre;Antonio Jiménez-Velasco,et al Methylation status of Wnt signaling pathway genes affects the clinical outcome of Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia.[J]Cancer Science,2008(99):1865-1868.

[2] Danjie Jiang1,Qingxiao Hong1,Yusheng Shen et al The Diagnostic Value of DNA Methylation in Leukemia: ASystematic Review and Meta-Analysis[J]plos one 2014,9(5):e96822.

[3] 李俊华,詹 飞,陈 明.DAPK1基因启动子CpG岛甲基化在白血病发病机制中的研究,中华妇幼医学杂志(电子版)2011,7(3):189-191.