孙 林，刘 平，卓伟伟，方 霞，范海霞，吴海明(.江西农业工程职业学院，江西 樟树 3300； .江西四特酒业有限责任公司，江西 樟树 3300)

我国是世界上主要的油菜生产国，每年榨油产生的菜籽粕约600万t，菜籽粕中含有35%～45%的蛋白质[1]。菜籽粕中蛋白质含量丰富，但在畜禽养殖中作为蛋白质饲料添加量却远低于大豆粕，主要原因一是菜籽粕中含有大量的抗营养因子，二是菜籽粕中蛋白质的消化率较低[2]。目前，国内外对菜籽粕的研究多集中在去除抗营养因子方面[3-5]，对提高菜籽粕消化率的研究还较少。

目前，提高菜籽粕消化率主要通过降低菜籽粕中纤维素、木质素等物质含量和提高菜籽粕中蛋白质分解的多肽类物质含量来实现[6]。国内外采用的方法主要有物理处理法[7]、化学处理法[8]、酶处理法[9-10]、微生物发酵法[11]。微生物发酵法相对于其他方法具有成本低、营养损失少、操作简单、无污染等特点，是理想的提高菜籽粕蛋白质含量和多肽含量的方法。

本研究利用前期筛选的对菜籽粕中抗营养因子去除作用明显的植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌[5，12]加上黑曲霉菌对菜籽粕进行单菌和混菌发酵实验，研究各菌种对菜籽粕中粗蛋白质含量和多肽含量的影响，选出最佳的菌种组合和发酵条件，以获得低毒、高蛋白多肽的菜籽粕饲料，为菜籽粕的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

植物乳酸菌(Lactobacillusplantarum)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为本校实验室前期筛选的对菜籽粕中抗营养因子去除作用明显的保存菌种。黑曲霉菌(Aspergillusniger)由江西四特酒业有限责任公司提供。

1.1.2 原料

菜籽粕：由江西金佳谷物股份有限公司提供，水分含量11.2%,粗蛋白质含量36.2%，多肽含量1.11%，硫甙含量96.526 μmol/g，粉碎过40目筛备用。

麸皮：本地市售，含水量11.8%，粗蛋白质含量15.1%，粉碎过40目筛备用。

1.1.3 培养基

植物乳酸菌为MRS培养基，黑曲霉菌为察氏培养基，枯草芽孢杆菌为牛肉膏蛋白胨培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 种子及种子液的制备

将保存的菌种斜面接2环到各菌种增殖培养基。植物乳酸菌接种到MRS培养基，38℃，静置培养48 h；枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基，在30℃、120 r/min振荡培养48 h；黑曲霉菌接种到察氏培养基，28℃、120 r/min振荡培养48 h；从上述增殖菌液中，以5%的接种量分别接到各菌的发酵种子培养基中(培养基成分同各菌增殖培养基)，培养24 h，制成发酵种子液。

1.2.2 固态发酵培养

首先制备固态发酵培养基。将菜籽粕、麸皮(按添加量9∶1的配比)装入200 mL三角瓶中，搅拌均匀，按不同的水料比加入水，塞紧棉塞，裹牛皮纸封口，115℃灭菌20 min，出锅冷却后打散备用。其次将各菌种的发酵种子液以不同的接种量加入灭菌的固态发酵培养基中，搅拌均匀，封口发酵。发酵过程中定时取样，烘干粉碎，测定样品中粗蛋白质含量和多肽含量。

1.2.3 单菌发酵实验

按照1.2.2方法分别将各菌以6%接种量接入成分相同的固态发酵培养基(水料比1.5∶1)中，温度34℃进行单菌发酵实验，发酵48 h时采样测定样品中粗蛋白质含量和多肽含量。

1.2.4 混菌发酵菌种组合正交实验

将3种菌种按3种接种量进行三因素三水平正交实验，水料比1.5∶1、发酵温度34℃、发酵时间24 h 等发酵条件不变，采用L27(313)正交实验设计，以粗蛋白质含量和多肽含量为指标确定混菌发酵菌种的最佳组合和接种比例，研究影响混菌发酵效果的主次菌种。

1.2.5 混菌发酵条件正交实验

设定水料比、发酵温度、发酵时间的三因素三水平的正交实验，采用混菌发酵选出的最佳菌种组合和接种比例，采用L9(34)正交实验设计，以粗蛋白质含量和多肽含量为指标确定发酵条件各因素对混菌发酵效果的影响，优化混菌发酵的条件。

1.2.6 相关指标测定

粗蛋白质含量的测定：凯氏定氮法[13]。多肽含量的测定:三氯乙酸法(TCA法)[14]。

1.2.7 数据处理

本实验数据处理采用SAS9.0 软件中的ANONA和GLM语句的方差分析程序；多重比较采用Duncan进行。

2 结果与分析

2.1 单菌发酵实验

2.1.1 各菌种对发酵菜籽粕粗蛋白质含量的影响(见图1)

图1 各菌种对发酵菜籽粕粗蛋白质含量的影响

由图1所示，各菌种对发酵菜籽粕中粗蛋白质含量均有一定的提高，其中以黑曲霉菌发酵菜籽粕中粗蛋白质含量最高，达到38.4%,相对于空白样(粗蛋白质含量34.09%)提高4.31个百分点。枯草芽孢杆菌发酵菜籽粕中粗蛋白质含量也较高，达到37.9%。这可能与黑曲霉菌和枯草芽孢杆菌的酶系含有纤维素酶、木质素酶、多糖酶等有关[15-17]，其能够分解纤维素和木质素等多糖类物质生产菌体蛋白，同时提高蛋白质在菜籽粕中的相对含量。

2.1.2 各菌种对发酵菜籽粕多肽含量的影响(见图2)

图2 各菌种对发酵菜籽粕多肽含量的影响

由图2所示，各菌种对菜籽粕多肽含量均有一定的影响，黑曲霉菌发酵菜籽粕中多肽含量最高，达到3.682%，相对于空白样1.002%，提高2.68个百分点。其次为枯草芽孢杆菌，多肽含量最低的为植物乳酸菌。研究发现，黑曲霉具有较高的分泌蛋白酶的能力[18-19]，可以将蛋白质进一步分解为多肽类物质，与本实验的结论相同。枯草芽孢杆菌同样具有分泌蛋白酶的特性[20-21]，其发酵菜籽粕中多肽含量仅次于黑曲霉菌。植物乳酸菌发酵菜籽粕中多肽含量最低，这可能与植物乳酸菌的酶系以糖酶、脂肪酶、产酸酶为主[22]，对蛋白质的分解能力较差，无法将菜籽粕中的蛋白质进一步分解为多肽类物质。

2.2 混菌发酵菌种组合正交实验

按照1.2.4实验方法进行混菌发酵菌种组合正交实验。正交实验因素水平见表1, 混菌发酵菌种组合L27(313)正交实验设计及结果见表2。

表1 混菌发酵菌种组合正交实验因素水平

由表2所示，3种菌对菜籽粕中粗蛋白质含量的影响主次顺序为：黑曲霉菌>枯草芽孢杆菌>植物乳酸菌，说明黑曲霉菌对提高菜籽粕中粗蛋白质含量的作用最明显，枯草芽孢杆菌次之，植物乳酸菌最差，这与单菌发酵效果相符。3种菌对菜籽粕中多肽含量的影响主次顺序为：黑曲霉菌>枯草芽孢杆菌>植物乳酸菌，说明黑曲霉菌对提高菜籽粕中多肽含量的作用最大，枯草芽孢杆菌次之，植物乳酸菌最差，与单菌发酵实验结果一致。

表2 混菌发酵菌种组合L27(313)正交实验设计及结果

利用SAS9.0对上述正交实验的结果进行方差分析，结果见表3。

由表3所示，在混菌发酵提高菜籽粕粗蛋白质含量的各菌种中，黑曲霉菌的影响达到差异显著水平(P<0.05),其他各菌种的影响未达到差异显著水平(P>0.05),说明黑曲霉菌是混菌发酵提高菜籽粕粗蛋白质含量的主要因素。实验结果表明，混菌发酵提高菜籽粕粗蛋白质含量的菌种组合中黑曲霉菌是必备的。各菌种在混菌发酵提高菜籽粕粗蛋白质含量的影响中没有显著的交互作用。

表3 混菌发酵菌种组合 L27(313)正交实验方差分析

在混菌发酵提高菜籽粕多肽含量的各菌种中，黑曲霉菌的影响达到差异极显著水平(P<0.01)，枯草芽孢杆菌的影响达到差异显著水平(P<0.05)，说明提高菜籽粕多肽含量主要受黑曲霉菌和枯草芽孢杆菌的影响，植物乳酸菌的影响未达到差异显著水平(P>0.05)。各菌种在混菌发酵提高菜籽粕多肽含量的影响中没有显著的交互作用。因此，混菌发酵提高菜籽粕多肽含量需要添加黑曲霉菌和枯草芽孢杆菌。

综合考虑，混菌发酵中黑曲霉菌和枯草芽孢杆菌对提高菜籽粕粗蛋白质含量和多肽含量作用明显，是必须添加的。因此，选择黑曲霉菌和枯草芽孢杆菌接种量均为6%(表2中的实验号18和实验号26)。由于植物乳酸菌在前期筛选中对硫甙去除作用明显，为获得高蛋白多肽菜籽粕的同时保证菜籽粕的低毒，选择按4%接种量添加植物乳酸菌。因此，混菌发酵菌种组合为植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌，接种量分别为4%、6%、6%。

2.3 混菌发酵条件正交实验

按照2.2选出的最佳菌种组合(植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌接种量分别为4%、6%、6%)进行混菌发酵接种，按照1.2.5 实验方法进行混菌发酵条件正交实验。混菌发酵条件的正交实验因素水平见表4,混菌发酵条件L9(34)正交实验设计及结果见表5。

表4 混菌发酵条件正交实验因素水平

由表5所示，对混菌发酵提高菜籽粕粗蛋白质含量影响因素最大的是发酵时间，其次是水料比，影响最小的是发酵温度；各因素的较优水平为发酵温度34℃、水料比1.7∶1、发酵时间48 h。 混菌发酵提高菜籽粕多肽含量影响因素最大的是发酵时间，其次是水料比，影响最小的是发酵温度；各因素的较优水平为发酵温度34℃、水料比1.7∶1、发酵时间48 h。

表5 混菌发酵条件L9(34)正交实验设计及结果

利用SAS9.0对上述正交实验的结果进行方差分析，结果见表6。

表6 混菌发酵条件L9(34)正交实验方差分析

由表6所示，在混菌发酵提高菜籽粕粗蛋白质含量的各因素中，发酵时间的影响达到差异显著水平(P<0.05),发酵温度和水料比的影响差异不显著(P>0.05)。在混菌发酵提高菜籽粕多肽含量的各因素中，发酵时间、发酵温度、水料比的影响均达到差异极显著水平(P<0.01)，表明各菌种产蛋白酶分解多肽的过程对各发酵因素比较敏感。

综合分析，采用植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌接种量分别为4%、6%、6%，在发酵温度34℃、水料比1.7∶1、发酵时间48 h条件下进行混菌发酵，发酵菜籽粕粗蛋白质含量为42.5%，多肽含量为7.86%。并在上述条件下对菜籽粕发酵前后的营养成分进行测定，结果见表7。

表7 菜籽粕发酵前后营养成分对比

由表7所示，发酵后的菜籽粕粗蛋白质含量和多肽含量较发酵前均有所增加，菜籽粕中的抗营养因子硫甙含量、植酸含量及单宁含量都较发酵前大幅下降。可见菜籽粕经混菌发酵后质量得到了提高。

3 结 论

(1)在单菌发酵实验中，菜籽粕经植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌发酵48 h后粗蛋白质含量和多肽含量均有提高，其中黑曲霉菌的作用最明显，菜籽粕粗蛋白质含量和多肽含量分别达到38.4%和3.682%。

(2)混菌发酵效果优于单菌发酵，混菌发酵的最佳菌种组合为植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌接种量分别为4%、6%、6%，优化的发酵条件为水料比1.7∶1、34℃下发酵48 h 。在上述最优条件下菜籽粕粗蛋白质含量 42.5%，多肽含量7.86%,抗营养因子硫甙含量降至21.637 μmol/g、植酸含量0.27%、单宁含量0.41 mg/g，得到高蛋白、多肽、低毒的菜籽粕饲料。

[1] 蒋新正.我国大豆、菜籽、花生等油料、油脂、饼粕的供需情况分析[J].中国油脂,2002, 27(6):73-74.

[2] TRIPATHI M K，MISHRA A S.Glucosinolates in animal nutrition：a review[J].Anim Feed Sci Technol，2007，132：1-27.

[3] 彭健，蒋思文.双低菜籽粕中的抗营养物质及降低措施[J].中国饲料，2001(14)：7-9.

[4] WU M C,LI X D.Study on removal of glucosinolates ,tennis and phytates from rapeseed meal[M].New York: Science Press New York,2001: 292-298.

[5] 孙林，李吕木，张邦辉,等.多菌种固态发酵菜籽粕的研究[J].中国粮油学报，2009，24(1)：85-89.

[6] GUO H，KOUZUMA Y，YONEKURA M.Structures and properties of antioxidative peptides derived from royal jelly protein[J].Food Chem，2009，113(1)：238-245.

[7] 严奉伟,吴谋成,江洪,等.菜籽粕综合提取工艺研究[J].农业工程学报,2004,20(3)：209-212.

[8] 严梅荣,王丹丹,鞠兴荣.碱性蛋白酶和亚硫酸钠水解菜籽粕制取菜籽多肽的研究[J].中国粮油学报，2010,25(3)：45-49.

[9] 杜冬梅,郭华,邹正.酶解菜籽粕制备多肽的研究[J].现代食品科技，2011，27(11):1344-1348.

[10] 杨雪,李云亮,王禹程,等.酶解法制备菜籽多肽的工艺研究[J].中国饲料，2017(2):19-21.

[11] 何荣海,蒋边,朱培培,等.枯草芽孢杆菌固态发酵菜籽粕生产多肽及降解硫苷的研究[J].食品工业科技，2014,35(10):228-233.

[12] 孙林,李吕木,张邦辉,等.多菌种固态发酵去除菜籽粕中的植酸[J].中国油脂，2008，33(8)：60-63.

[13] 张丽英.饲料分析与饲料质量检测技术[M]. 2版.北京：中国农业大学出版社，2002：49-53.

[14] 鲁伟,任国谱,宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的测定方法[J].食品科学，2005，26(7)：169-171.

[15] 胡德朋,唐家毅，曹星，等.枯草芽孢杆菌的分离鉴定及酶系分布的研究[J].水产科学,2008,27(2):86-88.

[16] 戴四发，贺淹才,谢德镳，等.黑曲霉液体发酵分泌纤维素酶系特性的研究[J].粮油食品科技，2004,12(2):36-39.

[17] 刘中美,谢梦圆,周哲敏.黑曲霉-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质[J].食品与生物技术学报，2015,34(11):1198-1202.

[18] 王文娟,宋俊梅,曲静然.黑曲霉发酵豆粕产蛋白酶活性的研究[J].中国酿造，2007(5):23-26.

[19] 孙婕,尹国友,陶战霞,等.黑曲霉发酵韭菜籽产蛋白酶活力的工艺研究[J].食品工业科技，2015,36(14):66-71.

[20] 王晓云,王慧,赵燕,等.紫外诱变选育高活性蛋白酶枯草芽孢杆菌及其降解饲料能力评价[J].中国水产科学，2016,23(6):77-83.

[21] 李洪康,李由然,李赢,等.枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化[J].食品与发酵工业, 2016,42(5):102-107.

[22] 沈莲清,苏光耀,王向阳.植物乳杆菌素研究进展[J].食品与生物技术学报，2006,25(5):121-126.