林冬果+林锦琼+李佩文+杨娜+徐邦牢+刘大渔��

摘要构建了一种具有自动形成细胞培养阵列和多步骤灵活操作特点的开放式微流控芯片。此芯片具有3层复合式结构： 底层为微通道贯穿的细胞培养池阵列，顶层是开放式培养池，二者之间为一层纳米孔薄膜。纳米孔薄膜具有“透气阻水”的特性，既起到止流阀作用实现液体自动分配，又允许跨膜扩散，模拟血管内皮层扩散屏障结构。结合移液工作站，开放式微流控芯片可以完成细胞换液、药物处理和细胞活力测试等一系列分析步骤。本研究以乳腺癌细胞为模型，在芯片上90 s内可构建包含三维细胞培养和仿真血管内皮的10×10肿瘤组织微阵列。形态学和免疫组织化学检测证实了芯片肿瘤组织的仿真效果。抗肿瘤药物测试结果表明，这种开放式微流控组织阵列芯片允许在仿真条件下进行包含复杂操作步骤的细胞实验，是细胞研究的有利工具。

关键词开放式微流控芯片； 纳米孔薄膜； 三维细胞培养； 组织微阵列； 抗肿瘤药物测试

1引 言

微流控芯片是细胞生物学研究的有力工具，除了微流控芯片所共有的特点，如高通量、低试剂消耗和功能集成[1～5]，微流控细胞分析芯片的另一优势是可在微尺度条件下重建细胞微环境[6]。一方面，微流控芯片便于利用各种形式的微结构实现3D细胞培养，以模拟生物组织结构[7，8]； 另一方面，微流控芯片具有与微血管尺度相似的通道网络，便于实现精确的流体控制以仿真血管[9，10]。3D细胞培养与微流控网络的结合，可以在芯片上构建仿真组织乃至器官芯片系统。

文献报道的微流控细胞培养系统多采用灌流培养方式，这些芯片使用微通道网络串联细胞培养单元[11～14]。灌流通道网络有利于实现细胞分布，从而构建高密度细胞培养阵列，还可以实现微血管功能，保证及时的物质交换[15，16]。然而，灌流培养芯片也面临着一些挑战，如难以精确控制和测量微通道内特定位置的pH值、氧气和细胞营养水平； 连续灌流导致的试剂消耗增加； 应对复杂操作的灵活性限制[17～20]。

为解决现有微流控细胞培养芯片的限制和不足，研究者提出了开放式微流控芯片[21～23]。这类芯片使用开放式细胞培养池，因而可以同时或顺序地加入不同的物质作用于细胞。与封闭式微流控芯片相比，开放式微流控芯片更有利于实现多种类型的多步骤复杂操作[24～26]。但是，由于开放式微流控芯片通常没有微通道网络，因而无法通过液体流动分布构建高密度细胞阵列。因此，开放式微流控芯片的分析通量大多有限。为解决这个问题，Zhu等[27]发展了一种结合了自動移液平台的半开放式微流控芯片。这种半开放式微流控芯片使用油包水液滴作为细胞培养器，而培养液交换、药物处理和细胞活性测试等一系列操作可通过安装在移液平台上的毛细管在微量注射泵控制下顺序完成。该课题组利用这种半开放式微流控芯片系统实现了高密度悬浮细胞培养阵列的程序化操作[28]，显示出了灵活性和高通量的优点。

在上述工作启发下，本研究构建了一种多层复合结构的开放式微流控芯片，以实现高度仿真条件下的多步骤复杂细胞操作。这种微流控芯片包含3层结构： 底层为微通道贯穿的细胞培养池阵列，顶层是开放式培养池，二者之间为一层纳米孔薄膜。纳米孔薄膜具有“透气阻水”的特性，既可以起到止流阀作用， 实现液体自动分配，又允许跨膜扩散，模拟血管内皮层扩散屏障结构。这种微流控芯片的优势在于： （1）借助自动液体分散构建高密度细胞培养阵列，便于实现高通量分析； （2）结合了3D细胞培养和仿真血管内皮层，允许在仿真微环境下进行细胞实验； （3）开放式芯片结构提供了液体操作的最大灵活性和微环境稳定性。本研究以乳腺癌细胞为模型，在芯片上构建了肿瘤组织微阵列，并评价了其生物仿真性能。抗肿瘤药物测试结果表明，此开放式微流控组织阵列芯片允许在仿真微环境条件下进行包含复杂操作步骤的细胞实验，可成为细胞研究的有利工具。

2实验部分

21仪器与试剂

IX71倒置荧光显微镜、IX81激光共聚焦显微镜（日本 Olympus公司）； TS2A微量注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）。

聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）前体及引发剂（美国Dow Corning公司）； 聚碳酸酯（Polycarbonate， PC）薄膜（孔径200 nm，英国Whatman公司）； SU8 3035光刻胶及显影液（美国MicroChem公司）； PBS、DMEM培养基、1640培养基、025%胰蛋白酶EDTA溶液、细胞核染料DAPI（4'，6diamidino2phenylindole）、 鬼笔环肽（Phalloidin）、钙黄绿素AM /溴化乙锭二聚体1（Calcein AM/EthD1）混合细胞染料（美国Thermo Fisher公司）； 抗vinculin单克隆抗体（美国 Pierce公司）； 抗ECadherin单克隆抗体（美国， BD）， 抗βCatenin单克隆抗体（英国ABCAM公司）； FITC、Cy3荧光标记二抗（武汉博士德公司）。DMEM培养基、胎牛血清（美国Sigma公司）； 盐酸阿霉素、紫杉醇（深圳万乐药业公司）； 海藻酸钠、Triton X100、多聚甲醛（上海生工公司）。所有试剂均为分析纯。硅片（直径4 英寸， 浙江立晶硅材料有限公司）。MCF7乳腺癌细胞株由中山大学肿瘤中心提供。

22微流控芯片结构与加工

微流控芯片包含3层结构（图1）： PDMS底层使用标准软刻蚀工艺[29]加工，包含10×10串联细胞培养池，每个串联培养池单元有流体入口和出口。PDMS顶层是使用PDMS平板打孔后获得的具有一系列通孔结构，封接后形成储液池阵列，与底层的细胞培养池对应。两层PDMS之间封接有PC薄膜。按Aran等 [30]报道的方法将PC膜先后与底层和顶层封接，得到完整芯片。

23细胞培养

人乳腺癌MCF7细胞用DMEM培养基（含10%胎牛血清）在37℃ 5% CO2条件下培养，每两天更换培养基。细胞增殖至70%～80%表面覆盖度时， 025%胰蛋白酶EDTA溶液消化3 min，加入新鲜的DMEM培养基终止消化，1000 r/min离心3 min，弃上清液。细胞重悬于含2%海藻酸钠的DMEM培养基中备用。endprint

24芯片上的细胞种植与培养

芯片和聚四氟乙烯毛细管在使用前，置于80℃烘箱中烘烤1 h。微量注射器在75%乙醇中浸泡6 h， 用灭菌蒸馏水冲洗3遍。使用前，芯片、毛细管和注射器均置于紫外灯下照射。使用时，在洁净操作台上通过毛细管连接芯片与微量注射器。

使用注射泵将细胞悬液（3×106 细胞/mL）从芯片入口处以30 mL/min的流量引入芯片。待细胞悬液填充所有细胞培养室后，将过量的液体从出口排出。顶部培养池加入40 mmol/L CaCl2溶液3 μL，保留15 min后，用等体积DMEM培养基替换。将芯片安装于一个塑料盒内，盒子底面放有生理盐水（含05% Triton X100）润湿滤纸。封闭盒盖后，将芯片连同塑料盒转移到37℃、5% CO2培养箱中。在随后的3天内，每次更换培养液时将塑料盒安放在移液工作站上，并打开盒盖。移液工作站上的三维步进电机和注射器协同操作实现芯片上定量定位液体转移。完成移液后，合上盖子，并将该芯片置于培养箱中培养。

25细胞成像

细胞培养3天后，用等体积Calcein AM/EthD1染料混合液置换培养基，避光保存20 min后移去荧光染液，然后将芯片置于倒置荧光显微镜观察并成像。平行实验中，从微流控芯片中取出水凝胶块，并转移到含EDTANa2的小瓶中。海藻酸钙凝胶与Ca2+螯合剂EDTA接触时溶解，释放的细胞团用冷PBS快速洗涤，并用多聚甲醛溶液（37%，PBS中）固定15 min。将收集的细胞按照文献[31]的方法包埋在瓊脂糖中，再将琼脂糖包埋在石蜡块中，用于制备组织切片。组织切片用于HE染色和免疫荧光成像。

26细胞活力评估

Calcein AM/EthD1染色后，活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。细胞存活率p按公式（1）计算：

p=NG/（NG + NR）× 100%（1）

其中， NG 和NR分别是绿色荧光和红色荧光细胞数量。

27抗肿瘤药物测试

芯片培养第3天显微镜下确认肿瘤微球形成后，将系列浓度阿霉素和紫杉醇作用于芯片培养细胞。芯片上的药物处理步骤包括： （1）移去旧培养基，将含有药物的培养液加入到指定的储液池中，芯片置于培养箱中24 h； （2）移去含有药物的培养液，用3 μL PBS溶液洗涤2次去除药物残留； （3）向储存池中加入Calcein AM/EthD1染色后，将芯片置于荧光显微镜下拍照。

对照2D培养组实验中，96孔板中每孔加入100 μL密度为106 细胞/mL的细胞悬液（DMEM培养基中），37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后分别加入含有系列浓度的抗肿瘤药物； 对照常规3D培养组实验中，96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液（密度3×106细胞/mL，分散于2%海藻酸钠DMEM培养基中），之后加入10 μL 40 mmol/L CaCl2溶液，保留15 min后用等体积DMEM培养基替换。随后3天内，每天更换培养液。2D和常规3D培养组的抗肿瘤药物处理与芯片培养组相同。

3结果与讨论

31微流控芯片设计

本研究设计了一种包含纳米孔薄膜的开放式微流控芯片。开放式微流控组织阵列芯片功能的实现有赖于纳米孔薄膜的特性。首先，纳米孔薄膜具有“透气阻水”的特性。这是因为纳米孔薄膜的滤过表面积极大，流经气体时摩擦力较小，因而可以自由通过，而流经液体时，摩擦力极剧增加，因而无法顺畅通过。在细胞悬液中添加了高粘度的海藻酸钠溶液，进一步增加了流动摩擦力。实验结果表明，在细胞悬液灌注过程中纳米孔薄膜可以保留液体而不发生泄漏。因此，纳米孔薄膜起到止流阀作用，利用这种芯片结构借助于液体的自动分配得以构建高密度细胞培养阵列； 其次，纳米孔薄膜孔径接近于内皮间隙尺寸，可模拟血管内皮层的扩散屏障作用。这种扩散屏障既允许溶液中分子的跨膜扩散，又能避免液体转移时对细胞的扰动。在微流控芯片细胞培养体系中，3D培养细胞模拟实体组织； 水凝胶可以支持、滋养和保护细胞，仿真间质； 而纳米孔薄膜模拟血管内皮层（图1B）。因此，这种开放式微流控组织阵列芯片允许在仿真微环境条件下进行各种类型包含复杂操作步骤的细胞测试。

32微流控芯片上组织阵列的构建

在芯片底层进样通道中，细胞悬液流动方向依据主通道和分支通道的阻力变化而调整（图 2）。初始状态下，主通道内的流动阻力较大，因而细胞悬液先流入分支通道并填充细胞培养室，同时将培养室内的空气经薄膜排出。当液体接触到纳米孔薄膜时，流动阻力迅速增加，分支通道的阻力增大，细胞悬液重回到主通道。以此类推，细胞悬液顺序填充一系列串联的培养池。细胞悬液可在90 s内完成所有培养池填充（图 2B）。由于纳米孔薄膜的流动阻力足够高，细胞悬液未发生泄漏。完成细胞分散后，将CaCl2溶液加入顶部培养层。Ca2+经薄膜扩散至下方培养室，形成海藻酸钙水凝胶，作为支撑3D细胞培养的支架。

细胞连续培养3天内，荧光染色结果显示细胞密度持续增加。连续荧光密度分析显示，每天的细胞增殖率约为70%。至第3天，可见肿瘤球结构形成（图 3），细胞活性检测结果表明，肿瘤球内细胞存活率为96%。上述结果表明，开放式微流控芯片上肿瘤组织阵列已经形成。

33芯片肿瘤组织的仿真性

共聚焦激光扫描显示芯片微室内的MCF7细胞在培养第3天形成肿瘤球结构（图4A）。HE染色的组织切片显示类肿瘤组织结构的形成，肿瘤细胞形成团状，局部具有不完全极性的腺管结构（图4B）。免疫荧光成像观察MCF7细胞在2D和3D芯片培养条件下， 肿瘤细胞F肌动蛋白（Factin）、粘着蛋白（Vinculin）、E钙粘蛋白（ECadherin）和β钙粘蛋白（βCatenin）的表达模式的差别（图 5）。在2D培养细胞中，MCF7细胞的Factin表达水平较低，并且多分布于细胞膜连接处，而在芯片3D细胞培养中，Factin在细胞质中均匀表达； ECadherin是上皮细胞间连接蛋白，其在芯片3D细胞培养的微流控芯片中表达也增高，提示肿瘤细胞上皮分化。βCatenin和Vinculin分别是细胞细胞连接蛋白和细胞间质连接蛋白，这两种蛋白在2D培养细胞中均呈散点状分布，提示上述蛋白定位不当。相比之下，芯片3D培养肿瘤细胞的βCatenin和Vinculin都均匀表达在膜上。上述结果表明，一系列结构蛋白在芯片3D培养条件下的表达和定位均接近体内状态。因此，芯片3D培养条件下的肿瘤细胞可以高度仿真实体肿瘤组织。endprint

34抗肿瘤药物反应测试

细胞培养3天后，顺序完成以下芯片操作： （1）移去旧培养基； （2）含有不同药物的培养液加入指定的储液池中； （3）药物处理24 h后移去含有药物的培养液； （4）洗涤去除药物残留； （5）向储存池中加入Calcein AM/EthD1染色； （6）移除染液； （7）储液池中补充PBS液。上述一系列操作在移液工作站上程序化完成，操作简便。

在不同的培养环境中，MCF7细胞对药物的反应不同（图6）。 根据实验结果计算的IC50值依照2D→普通3D→芯片3D的趋势递增，这种趋势在紫杉醇测试中尤为明显（见图6B）。在2D培养中，由于扩散屏障的缺失，药物可以高效地进入细胞， 因而杀伤作用非常明显。相比之下，简单的水凝胶3D培养模式下细胞对药物的敏感性有所降低。这是由于肿瘤球结构的形成模拟了肿瘤实质，而水凝胶模拟了细胞外基质，这些扩散屏障削弱了细胞杀伤作用。相比普通3D培养，芯片3D培养细胞对抗肿瘤药物的敏感性进一步降低。这可能是因为纳米孔薄膜仿真了血管内皮层结构，进一步限制了药物向肿瘤细胞的扩散。因此，血管内皮层扩散屏障的模拟对于构建仿真肿瘤组织至关重要。本研究发展的微流控芯片构建包括血管内皮层、细胞外基质和肿瘤实质的完整扩散屏障结构，是实现体外抗肿瘤药物测试的有利的技术平台。

4结 论

本实验设计一种开放式组织阵列微流控芯片。此芯片系统具有以下特性： （1） 通过自动液体分配简易地实现高密度细胞培养阵列； （2） 结合仿真血管内皮层和3D培养细胞构建仿生肿瘤组织； （3） 能够灵活应对包含复杂操作的细胞测试。本研究提出的微流体体系灵活且易于使用，可为仿生微环境条件下进行复杂的多步骤细胞分析提供理想的工具。

References

1ElAli J， Sorger P K Jensen K F Nature， 2006， 442（7101）： 403-411

2LI DongShun， XU Yi， PENG JinLan， ZHOU Zhen， GAN Jun， WANG Rao Chem J Chinese Universities， 2012， 33（1）： 63-67

李栋顺， 徐 溢， 彭金兰， 周 桢， 甘 俊， 王 尧 高等学校化学学报， 2012， 33（1）： 63-67

3Mehling M Tay S Curr Opin Biotechnol， 2014， 25： 95-102

4Marimuthu M Kim S Anal Bbiochem， 2011， 413（2）： 81-89

5QI MingYue， DU Yan， LIU WeiPing， CHEN Bin， LIANG GuangTie， XU BangLao， LIU DaYu Chinese J Anal Chem， 2016， 44（4）： 610-616

齐明月， 杜 燕， 刘未平， 陈 斌， 梁广铁， 徐邦牢， 刘大渔 分析化学， 2016， 44（4）： 610-616

6Young E W Beebe D J Chem Soc Rev， 2010， 39（3）： 1036-1048

7van Duinen V， Trietsch S J， Joore J， Vulto P Hankemeier T Curr Opin Biotechnol， 2015， 35： 118-126

8WANG WeiXin， LIU WeiPing， WU Bin， LIANG GuangTie， LIU DaYu Chinese J Anal Chem， 2015， 43（5）： 637-642

王偉鑫， 刘未平， 吴 斌， 梁广铁， 刘大渔 分析化学， 2015， 43（5）： 637-642

9Li X J， Valadez A V， Zuo P， Nie Z Bioanalysis， 2012， 4（12）： 1509-1525

10Inamdar N K Borenstein J T Curr Opin Biotechnol， 2011， 22（5）： 681-689

11Nalayanda D D， Puleo C M， Fulton W B， Wang T H Abdullah F Exp Lung Res， 2007， 33（6）： 321-335

12Hung P J， Lee P J， Sabounchi P， Lin R， Lee L P Biotechnol Bioengineer， 2005， 89（1）： 1-8

13Huang S B， Wang S S， Hsieh C H， Lin Y C， Lai C S， Wu M H Lab Chip， 2013， 13（6）： 1133-1143

14Huang S B， Wu M H， Wang S S Lee G B Biomed Microdevices 2011， 13（3）： 415-430

15Evander M， Johansson L， Lilliehorn T， Piskur J， Lindvall M， Johansson S， Almqvist M， Laurell T， Nilsson J Anal Chem， 2007， 79（7）： 2984-2991

16Toh Y C， Zhang C， Zhang J， Khong Y M， Chang S， Samper V D， van Noort D， Hutmacher D W， Yu H Lab Chip， 2007， 7（3）： 302-309endprint