王娟红 ，臧 明 ，郑毛亮 ，常卫华

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木兵团畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；3.河南省武陟县动物卫生监督所，武陟 454950）

母羊胎产羔数和发情次数是衡量绵羊高产的两个重要指标。绵羊常年发情或季节性发情是一个复杂的调控过程，除激素外，一些主效基因或蛋白对其也起到关键的作用。近年来，随着分子生物技术的高速发展，有关绵羊发情的分子方面的研究也越来越深入，绵羊的发情研究已从最初对少量主效基因的研究发展到转录组学和蛋白组学水平上的研究［1-6］。本文对近年来利用转录组学和蛋白组学技术对绵羊繁殖调控方面的研究作一总结和分析，为同行提供一定参考。

1 绵羊重要繁殖特性基因调控的转录组学研究进展

转录组学（transcriptome）是指在某一生理条件下，机体细胞内所有转录产物的集合，包括小RNA（small RNAs，sRNA）、信使 RNA（mRNA）及一小部分基因间区和基因区的非编码RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）。目前应用于转录组学的技术有：表达序列标签、DNA微阵列技术、基因表达序列分析以及全转录组鸟枪法测序。2005年以来，新一代高通量测序技术相继诞生，包括Illumina/Solexa测序、ABI/SOLiD和 Roche/454测序等，这些高新技术为主效基因的挖掘及功能研究提供了更为广阔的平台。

朱广琴［7］通过SSH技术构建文库的方法从奶山羊发情期卵巢中筛选出DCN、OAZ1、EPHX1和FSHR基因，实时定量PCR及生物信息学分析证实这些卵巢内基因均与母羊产羔数呈显著正相关。有研究利用RNA-seq技术获得了小尾寒羊不同繁殖状态下的基因表达模式，提出TGF-β信号通路中FSTL3、SMAD1、SMAD4和TGFBRII基因及胰岛素信号通路中的BAD基因可能对常年发情有一定的调控作用。研究证实，卵巢卵泡液含有高浓度的褪黑素，而且在颗粒细胞内有褪黑素受体的表达，对卵巢功能具有一定的调控作用［8-10］。Di等［11］通过高通量测序技术对发情季节的滩羊和小尾寒羊卵巢进行了miRNA研究，鉴别出183条不同miRNA家族的483条miRNA，在乏情期其中25个表达差异显著，对发情具有重要的调控作用。Shi等［12］对济宁青山羊卵巢研究发现，雌激素受体α和β、孕酮受体mRNA的表达具时空特异性，该差异性与繁殖特点有关。Aungier等［13］研究证实，GnRH调控着E2浓度的增加与发情活动之间的关系，E2波峰后随浓度增加，仍有90%以上动物保持发情行为。Ling等［14］研究指出，FER1L4、SRD5A2基因在安徽白山羊和布尔羊不同组织中表达模式不同，推测该基因可能与安徽白山羊的多胎性有关。Chang等［15］利用高通量测序技术对甘肃高山细毛羊黄体期卵巢小RNA进行了研究，获得9321775条cleanreads和267条候选miRNA，研究证实候选miRNA Ovis_aries_ovary-m0033_3p 为卵巢特异性 miRNA。Miao 等［16］通过转录组技术分析了不同品种绵羊mRNA与miRNA的表达水平，其研究结果有助于鉴别繁殖调控相关候选基因。Abadjieva 等［17］研究证实，GDF9 和 BMP15 在卵巢和颗粒细胞内表达，而且蒺藜皂甙可以改变GDF9和BMP15在兔子卵巢和F1雌性后代中的表达模式。Chang等［18］研究指出，BMPs/GDFs是卵泡形成及卵巢功能的重要因子，调控生殖疾病及不育等通路信号。Yang等［19］研究指出，非发情季节在生殖内分泌及卵巢生理系统中PLA2G4D能直接调控卵泡发育，间接影响瘦素的分泌。Yang 等［20］研究表明，chemerin/GPR1 信号通路在卵泡发育、黄体形成和黄体溶解中直接或间接调控孕激素的合成及分泌。黄冬维等［21］研究发现，2型脱碘酶基因（type Ⅱiodothyronine deiodinase gene，DIO2）和3型脱碘酶基因（type Ⅲ iodothyronine deiodinase gene，DIO3）与羊的季节性发情调控有关，而且DIO3基因可能负调控发情活动。付绍印等［22］通过比较转录组分析发现，神经活性的配体－受体相互作用信号通路在下丘脑－垂体－卵巢性腺轴调控排卵及卵泡发育方面发挥着重要的调控作用，筛选了影响产羔数的相关基因，丰富和补充了绵羊基因组信息。

从文献报道来看，卵巢上的一些关键基因对卵巢活动及功能的发挥起着非常重要的作用，而通过转录组学可以筛选到一些调控的关键基因［23-25］，尤其是在多浪羊常年发情主效基因的筛选上意义重大。

2 绵羊重要繁殖特性调控蛋白组学研究进展

Wilkins和Williams于1994年第一次提出蛋白质组（proteome）这一概念，但直到1995年7月，蛋白质组这一概念才在《Electrophoresis》杂志上出现，当时对蛋白质组概念定义为基因组所表达的全部蛋白质及其存在方式［26］。经过二十几年的发展，现在的研究学者普遍认为蛋白质组是一个基因组、一种生物、一种细胞或一种组织所表达的全部蛋白质。而蛋白质组学是后基因组时代的一门新兴学科，指基因组在某个细胞或某种组织中表达的全部蛋白质及其存在方式，目的是从蛋白质层面揭示生物体的生理本质和生命活动规律，重点在于对蛋白质进行定量研究。而定量研究主要分为2个方面，一是基于凝胶技术的研究方法（如2-DE和2D-DIGE技术）和基于质谱技术的研究（如iTRAQ/SILAC、Label free和SRM/MRM）。其中同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ，isobaric tags for relative and absolute quantitation）技术是一种新的、功能强大的相对和绝对定量研究的方法，由美国应用生物系统公司（Applied Biosystems Incorporation，ABI）开发，该技术具有高精确性、高效率，而且重复性好，可以在一次串联质谱实验中同时比较4个、多可达8个样品中蛋白的相对含量。

Hamelin等［27］以比利时特塞尔绵羊品种为研究对象，调查了数量性状基因座（quantitative trait locus，QTL）引起的绵羊肌肉肥大是否对肌浆蛋白的表达产生影响，研究发现，只有α抗胰蛋白酶（Alpha-1-antitrypsin）在4种类型的肌肉中表达水平相似。预测这些蛋白可作为绵羊肌肉肥大的标志性蛋白，同时对研究正常肌肉的发育机制具有重要意义。Jia等［28］以绵羊卵巢组织为研究对象，建立了卵巢蛋白双向凝胶电泳（2-DE）最佳体系，对卵巢蛋白提取与处理、样品上样量以及等点聚焦电压、时间等条件做了优化，为其他动物卵巢组织的处理及2-DE提供了参考。Soleilhavoup等［29］报道，在黄体期，大量蛋白如血浆铜蓝蛋白、乳铁蛋白，DMBT1及PIGR与免疫系统有关，CD9和腓骨蛋白均与组织重构有关，而且myosin 9和纤维连接蛋白在发情期和黄体表面明显不同。2016年陈潇飞［30］利用iTRAQ蛋白表达谱共筛选到绵羊角蛋白2 356个，其中置信区间蛋白1 345个。正常两角与畸形角组共137个差异表达蛋白，正常多角与畸形角组共91个差异表达蛋白，两角与多角组共66个差异表达蛋白。正常角与畸形角组的差异蛋白主要富集在细胞外基质、组织发育、细胞外基质分解代谢和胶原蛋白代谢等过程；两角与多角组主要富集在细胞分泌和细胞外基质分泌等过程。同时利用Western Blotting和Q-PCR分别对iTRAQ结果进行验证，结果表明，使用蛋白表达谱iTRAQ技术筛选绵羊相关差异蛋白具有可靠性及准确性。Miao等［31］通过iTRAQ技术分析了小尾寒羊和无角陶赛特母羊卵巢蛋白，鉴别了上万个差异蛋白，GO和KEGG通路分析发现这些蛋白与氧化还原酶、细胞色素C氧化酶及载体等活性有关，该研究结果为小尾寒羊高繁殖力分子调控机理的理解提供基础。

可见，通过蛋白组学技术对绵羊重要繁殖调控细胞或组织内的蛋白质组成、表达水平、修饰情况以及蛋白质间相互作用关系等进行系统的分析，可以筛选到部分关键候选蛋白，而这些蛋白在绵羊重要繁殖性状及组织功能的发挥方面具有非常重要的作用，将在转录后揭示蛋白质与绵羊繁殖调控活动的内在联系和规律，为研究多浪羊等绵羊常年发情的繁殖机理提供基础。

3 转录组和蛋白组学的关联分析

转录水平的调控是生物体最基础、最主要的一种调控方式，在动物正常生长发育、抗病、组织器官功能的发挥及应激反应等过程中，细胞、组织等主效基因表达模式会发生显著变化。与基因组等其他组学相比，转录组研究的是机体某一组织或细胞中表达的全部RNA，包括mRNA、小RNA及小部分非编码RNA等，直接反映了组织或细胞主效基因表达模式的变化水平，而且转录测序结果不含内含子，测序数据分析方便。转录组学为研究机体内组织或细胞基因表达及调控提供了重要的技术和方法，同时也为主效基因或功能基因的挖掘提供了重要途径，是连接蛋白质组生物功能和基因组遗传信息的纽带［32］。相比而言，蛋白质组数据库数据相对较少，而且需要相应转录组信息给予验证。目前，蛋白质组检测结果的精确度及准确度比转录组要低一到两个数量级，组织或细胞内表达丰度比较低的一些蛋白现有技术无法检测到；而且目前获得的大部分转录组和蛋白质组的数据相关性比较差。因此，需要将二者的研究结果或数据相互关联，以进一步揭示功能基因或主效基因表达的转录后调控机制。Chalmel等［33］论述了在精子形成过程中，蛋白组学和转录组学的关联性及利用RNA-seq高通量测序转录组技术和MS-based蛋白组学技术能够发现新的蛋白编码基因及新的蛋白亚型的表达。

对转录组学分析获得的差异基因和同位素标记相对和绝对定量技术筛选的差异蛋白进行二者关联性分析，当组织或细胞内某个蛋白被鉴定到而且在转录组水平上有表达信息时，被认为关联到，然后分析二者之间的相关性；通过对多浪羊繁殖及调控组织进行蛋白质定量及其关联转录本作关联聚类分析及蛋白相互作用网络分析，获得调控多浪羊常年发情的主效基因。目前，虽然转录组学和蛋白组学研究的比较多，但是二者之间的关联性分析仍然很少，尤其是对新疆特有品种——多浪羊常年发情的调控机理研究尚属首次。

4 总结和展望

基因和蛋白质如何通过相互作用而调控相应生理活动，仍然是生物学家目前研究的热点问题。绵羊发情调控是个错综复杂的过程，并且受到一些主效基因的调控，而且这种调控作用研究非常少，随着科学技术的进展并通过逐步研究，相关的外部主要调控靶点及调控机理将会逐渐被研究者发现。目前，转录组学的研究方法发展非常迅速，相应技术已经相当成熟，而蛋白组学仍处在不断的成长、发展及完善阶段，对于生物样品中低拷贝的蛋白质目前仍旧无法扩增。随着高端仪器及科学技术的不断发展，获得的不同物种、不同组织器官的蛋白组数据也越来越多。而且，由于诸如同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）新型蛋白定量技术的出现，蛋白质的量化精确度也越来越高。转录后修饰技术如磷酸化研究发展迅猛，而且蛋白糖基修饰技术近几年也发展迅猛，但这些技术方法由于专业性强，对人员要求高，因此，应用明显受到限制，相对于透彻的转录组学分析其科研成果还远远不够。随着转录组学和蛋白组学数据之间的互补及验证，二者的联合分析在多浪羊等绵羊常年发情领域主效基因的挖掘及功能研究的应用方面会越来越广泛，再结合内分泌研究，其常年发情的分子调控机制将愈来愈清晰。

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