胡北 赵庆春 张朝绅 吴琼 马宏达

[摘要] 目的 建立止血养元口服液中蒙花苷和人参皂苷Rg1含量的高效液相色谱（HPLC）测定方法。 方法 采用HPLC对小蓟中蒙花苷和人参中人参皂苷Rg1进行含量测定。小蓟中蒙花苷的含量测定：流动相为甲醇-0.5%醋酸溶液（50∶50），检测波长为326 nm。人参中人参皂苷Rg1的含量测定：流动相为乙腈-水（20∶80），检测波长为203 nm。 结果 蒙花苷在5～160 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系（r = 0.9997），平均加样回收率为97.73%，RSD = 2.01%（n = 6）。人参皂苷Rg1在0.025～0.8 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系（r = 0.9998），平均加样回收率为98.62%，RSD = 2.48%（n = 6）；3批样品含量测定结果均符合要求。 结论 本研究所用含量测定方法简单准确、重现性好，能有效控制止血养元口服液的药品质量。

[关键词] 止血养元口服液；蒙花苷；人参皂苷Rg1

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（c）-0102-05

[Abstract] Objective To establish high-performance liquid chromatography （HPLC） method for the content determination of buddleoside and ginsenoside Rg1 in Zhixue Yangyuan Oral Liquid. Methods HPLC was used to determine the content of buddleoside in Herba Cirsii and ginsenoside Rg1 in Radix Ginseng. The content of buddleoside in Herba Cirsii was determinated with mobile phase consisted of methanol-0.5% acetic acid water （50∶50）. The detection wavelength was set at 326 nm. The content of ginsenoside Rg1 in Radix Ginseng was determinated with mobile phase consisted of acetonitrile-water （20∶80）. The detection wavelength was set at 203 nm. Results There was a good linear relationship between buddleoside and peak area in the range of 5-160 μg/mL （r = 0.9997） with an average recovery of 97.73%， RSD = 2.01% （n = 6）. There was a good linear relationship between ginsenoside Rg1 and peak area in the range of 0.025-0.8 mg/mL （r = 0.9998） with an average recovery of 98.62%， RSD = 2.48% （n = 6）. The content determination results of the three batches of samples all met the requirements. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible. It is effective in controlling the quality of Zhixue Yangyuan Oral Liquid.

[Key words] Zhixue Yangyuan Oral Liquid； Buddleoside； Ginsenoside Rg1

止血養元口服液是沈阳军区总医院（以下简称“我院”）自主开发的一个院内制剂品种，已经在我院临床科室使用多年，患者反映较好，本制剂由人参、小蓟、蒲黄、熟地黄、乌梅、川芎、紫珠叶7味中药组成，主要用于男子或妇人血热妄行、吐血、衄血、呕血、咯血等各种对应证候的出血。小蓟和人参为方中君药。本研究采用高效液相色谱法对小蓟中蒙花苷和人参中人参皂苷Rg1进行含量测定，并建立其方法，以期能更有效地控制止血养元口服液的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Thermo公司，U3000）；紫外-可见分光光度计（岛津公司，UV-1700）；电子分析天平（岛津公司，AUW 120D型，百万分之一）。

1.2 试药与试剂

蒙花苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111528-201509）；人参皂苷Rg1对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：110703-201128）；止血养元口服液（我院院内制剂，批号：20170207、20170315、20170320）；乙腈、甲醇（Sigma公司，色谱纯），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 小蓟中蒙花苷的测定

2.1.1 色谱条件 填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：甲醇-0.5%醋酸溶液（50∶50）；检测波长：326 nm[1-3]。理论塔板数按蒙花苷峰计算应不低于4000。

2.1.2 对照品溶液的配制 称取适量蒙花苷对照品，精密称定，加甲醇超声使其溶解[4-7]，制成20 μg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 精密量取本品2 mL，置于25 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 制备阴性对照溶液 取按处方除去小蓟的阴性样品2 mL，按照上述方法进行配制。

2.1.5 专属性考察 分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各5 μL，注入液相色谱仪，结果表明，阴性对照不干扰蒙花苷的测定，且其分离度均大于1.5，符合要求，表明此方法的专属性较强。见图1。

2.1.6 标准曲线的制备 精密吸取浓度为5、10、20、40、80、160 μg/mL的蒙花苷对照品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，按照“2.1.1”所述条件进行分析，以蒙花苷对照品的浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积值为纵坐标，得到回归方程：y = 110 86 x - 282 17，r = 0.9997。结果显示，蒙花苷对照品在5～160 μg/mL的范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.7 精密度试验 精密吸取5 μL蒙花苷对照品溶液，按照上述色谱条件进行分析，连续进样6次，分别记录蒙花苷对照品的峰面积，其RSD为1.52%（n = 6），符合要求。

2.1.8 稳定性试验 取同一批样品，精密量取2 mL，按照“2.1.1”所述的供试品溶液制备操作，按照上述色谱条件进行分析，分别在0、2、4、6、8、10、12 h，测定样品中蒙花苷的峰面积，测得其峰面积值的RSD为2.51%（n = 6），表明样品溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.9 重复性试验 取同一批样品，精密量取2 mL（共6份），按照上述供试品溶液配制方法操作，按照上述色谱条件进行分析，然后测得每份样品中蒙花苷的含量[8-9]。结果样品中蒙花苷的平均含量为0.2034 mg/mL，RSD为2.80%（n = 6），符合要求。

2.1.10 回收率试验 取同一批样品，精密量取1 mL（共6份），分别加入蒙花苷对照品溶液（0.114 66 mg/mL）各2 mL，再按“2.1.3”配制供试品溶液，制成回收率试验所用样品[10-11]，按照“2.1.1”所述色譜条件进行分析，测定样品中蒙花苷的含量，并计算其回收率，其平均回收率为97.73%，RSD为2.013%（n = 6），符合要求。结果见表1。

2.1.11 样品测定 取3个批号的止血养元口服液样品，按照“2.1.3”所述的供试品溶液制备方法进行操作，按照“2.1.1”所述色谱条件进行分析，测定每批样品中蒙花苷的含量，分别为0.2605 mg/mL（批号：20170207）、0.2052 mg/mL（批号：20170315）、0.2036 mg/mL（批号：20170320）。

2.2 人参中人参皂苷Rg1的含量测定

2.2.1 人参皂苷Rg1的含量测定色谱条件 填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：乙腈-水（20∶80）；检测波长：203 nm[12-16]。理论塔板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于5000。

2.2.2 制备对照品溶液 精密称定人参皂苷Rg1对照品，加适量乙腈超声使其溶解，制成0.12 mg/mL的溶液。

2.2.3 制备供试品溶液 精密量取本品25 mL，加三氯甲烷振摇提取3次，每次25 mL，弃去三氯甲烷提取液，水液加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，加氨试液洗涤2次，每次25 mL，弃去氨试液，再加用正丁醇饱和的水进行振摇洗涤2次，每次用25 mL正丁醇饱和的水，之后弃去水液，然后把正丁醇液浓缩至干，最后用乙腈把剩余残渣溶解，并将残渣转移至10 mL量瓶中，定容，即得供试品溶液[17-19]。

2.2.4 制备阴性对照溶液 取按处方除去人参的阴性对照样品25 mL，按上述方法进行制备。

2.2.5 专属性考察 分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各20 μL，注入液相色谱仪。结果表明，人参皂苷Rg1的含量测定不受阴性对照样品的干扰，其分离度均大于1.5，理论塔板数按人参皂苷Rg1峰计算应均不低于5000。结果表明，本方法的专属性较强。见图2。

2.2.6 标准曲线的制备 精密吸取人参皂苷Rg1对照品溶液（浓度分为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL）20 μL，注入液相色谱仪，再按照“2.2.1”所述条件进行分析，测定其峰面积，以人参皂苷Rg1浓度（mg/mL）为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得回归方程：y = 13 851x - 73，r = 0.9998。结果表明，人参皂苷Rg1在0.025～0.8 mg/mL的范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 精密吸取20 μL对照品溶液，按照“2.2.1”所述条件进行分析，连续进样6次，记录其峰面积，并测得其峰面积值的RSD为1.42%（n = 6），符合要求。

2.2.8 稳定性试验 取同一批样品，精密量取25 mL，按照上述供试品溶液制备操作，按上述色谱条件分析，分别在0、2、4、6、8、12 h，测定样品中人参皂苷Rg1的峰面积，其RSD为1.75%（n = 6），表明供试品溶液在12 h内稳定性较好。

2.2.9 重复性试验 取同一批样品，精密量取25 mL（共6份），按照上述供试品溶液配制方法进行操作，按照“2.2.1”所述条件进行分析，测得每份样品中人参皂苷Rg1的含量，其平均含量为0.0552 mg/mL，RSD为2.07%（n = 6），符合要求。

2.2.10 回收率试验 取同一批样品，取12.5 mL（共6份），精密量取，分别加入人参皂苷Rg1对照品溶液（0.704 mg/mL）各1 mL，再按“2.2.3”制备供试品溶液，制成回收率试验用样品[20-22]，按照“2.2.1”所述条件进行分析，测定样品中的含量，并计算其回收率，结果平均回收率为98.62%，其RSD为2.484%（n = 6），符合要求。见表2。

2.2.11 样品测定 取3个批号的止血养元口服液样品，按照“2.2.3”制备供试品溶液，按照“2.2.1”所述条件进行分析，并测定样品中人参皂苷Rg1的含量，分别为0.0396 mg/mL（批号：20170207）、0.0555 mg/mL（批号：20170315）、0.0482 mg/mL（批号：20170320）。

3 讨论

蒙花苷对照品易溶于热的甲醇溶液，故在配制蒙花苷对照品溶液的过程中，需要仔细进行观察，确保对照品能充分溶解，不仅需要进行超声辅助溶解，必要时可采用稍微加热的方法辅助其溶解，然后使其冷却至室温，再稀释至刻度。

人参中指标性成分的含量测定，考察了3种不同的方法对人参中指标性成分进行提取，采用乙腈-水为流动相，进行梯度洗脱，对人参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1进行检测，此方法干扰较大，而且其液相条件苛刻，故再换其他方法进行考察。采用等度洗脱进行测定人参中的指标性成分，同时考察3种不同提取方法，在这个条件下，这3种提取方法只检测到了人参皂苷Rg1及人参皂苷Re，未检测到人参皂苷Rb1，但是人参皂苷Re存在阴性干扰，故只能测定人参皂苷Rg1。

综上所述，本研究建立的HPLC法用于止血养元口服液中蒙花苷和人参皂苷Rg1的含量测定方法简单可靠，重复性好，能有效控制止血养元口服液的药品质量。

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（收稿日期：2018-03-28 本文编辑：张瑜杰）