陈 媞，龙友华，2，刘阿丽，2，黄文源，2，李荣玉，2，尹显慧，2，胡安龙，2，李 明，2，吴小毛，2*

( 1.贵州大学 作物保护研究所，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 贵州山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025)

土壤酶是土壤中具有催化能力的一些特殊蛋白质类化合物的总称[1]。土壤中的物质和能量转化离不开土壤酶的参与，因此可以根据一些土壤酶活性的变化来探明土壤中各类生物活动和化学过程的动向和强度。土壤酶活性不仅可以侧面反映土壤的肥力，还能作为研究自然物质循环和能量流动的重要参考。在探究污染物对土壤的影响时，土壤酶活性可以作为判断和评价污染程度的敏感指标[1-3]。

精异丙甲草胺(S-metolachlor) 是一种酰胺类除草剂，化学名为2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯基)-N-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙基]乙酰胺。精异丙甲草胺能够抑制发芽的杂草种子蛋白质的合成，对大部分一年生的单子叶杂草和某些阔叶杂草有良好的防除作用，在多种经济作物(玉米、烟草、蔬菜等)的田间除草上均有使用。酰胺类除草剂活性高，作用时间长，作用效果好，在农业活动中广泛施用的同时，其在土壤中的残留以及造成的污染也引发了人们的重视[3-5]。本研究选用花溪烟田土壤为材料，采用毒理学实验方法，记录并评价精异丙甲草胺胁迫下烟田土壤过氧化氢酶、脱氢酶、脲酶和磷酸酶的动态变化过程，为全面客观地评价精异丙甲草胺生态效应提供参考，也有助于在烟草生产活动中安全、合理地使用该药品。

1 材料与方法

1.1 供试药品及试剂

精异丙甲草胺标准品[≥ 97.7%，85%(S)isomer]购自美国迪马科技有限公司。甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为二次重蒸水。

1.2 仪器和设备

6890N气相色谱HP-5石英毛细管柱(美国Agilent)，SW-CJ-1FD 超净工作台 (杭州钱江仪器设备有限公司)，RE-52A型旋转浓缩蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，新世纪紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，AL104分析天平(瑞士梅特勒)，HZQ-Q恒温振荡器(常州澳华仪器有限公司)，GZX-9030MBE电热鼓风干燥箱(苏州江东精密仪器有限公司)，BIC-300人工气候培养箱(上海博讯)等。

1.3 土样采集和处理

1.3.1不同浓度精异丙甲草胺处理 土壤采自贵州贵阳花溪烟草种植试验地，分别称取500 g烟田土壤于1000 mL 烧杯中，28℃恒温培养7 d后，分别加入含精异丙甲草胺浓度为1、3、6、9、12 mg/kg的甲醇溶液中，待溶剂挥发后搅拌均匀，用蒸馏水调节土壤水分至土壤最大持水量的60%，每处理均设3次重复，同时设空白对照。

土样于25℃培养箱中恒温培养1、3、7、14、21、30、45和60 d后取样测定土壤过氧化氢酶、脱氢酶、脲酶和磷酸酶的活性。适时称重补充水分，保持土壤含水量恒定。

1.3.2根际土壤的采集与处理 在花溪烟草种植试验地中，采集以烤烟K326烟株为中心15 cm半径范围铲出整个土块，抖落多余土壤后，将烟株根系连同与之紧密黏附的土壤置于保鲜袋带回，仔细刷下并收集根系周围的土壤，风干，1 mm孔径过筛，作为烟株根际土壤。

分别称取2组500 g烟株根际土样(或花溪烟田土样)于1000 mL烧杯中，在其中1组根际土样(或烟田土样)中加入1 mL含精异丙甲草胺的甲醇溶液，使除草剂浓度均为6 mg/kg，用蒸馏水调节湿度至土壤最大持水量的60%，设置3个重复及1个空对照。培养方式同1.3.1。

1.4 测定对象和方法

过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定，脱氢酶活性采用三苯基四氮唑氯化物(TTC)比色法测定，脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定，磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定。

2 结果与分析

2.1 精异丙甲草胺对烟田土壤酶活性的影响

2.1.1过氧化氢酶

图1 精异丙甲草胺对烟田土壤过氧化氢酶活性的影响Fig.1 Effect of S-metolachlor contamination on activity of soil catalase

由图1可知，低浓度(1～3 mg/kg)处理下，过氧化氢酶活性表现为先激活后恢复；中等浓度(6 mg/kg)或高浓度(9～12 mg/kg)精异丙甲草胺处理下，土壤过氧化氢酶活性的变化趋势为激活-抑制-激活或恢复。试验前14d，各浓度处理对土壤中过氧化氢酶活性均表现为激活作用，且激活程度与处理浓度成正比关系，在1 d时，激活程度达到最大值。1、3、6、9、12 mg/kg精异丙甲草胺处理的激活率分别为9.47、19.51、25.57、34.85、40.53%，除1～3 mg/kg处理组外，处理之间的酶活性均存在显著差异。试验14 d后，各浓度的抑制作呈现出减弱趋势，其中低浓度(1～3 mg/kg)处理组的过氧化氢酶活性在21 d恢复至对照水平。而中、高浓度(6～12 mg/kg)处理组的酶活性从21 d开始被抑制，分别在45、60 d时恢复至对照水平。

2.1.2脱氢酶

图2 精异丙甲草胺对烟田土壤脱氢酶活性的影响Fig.2 Effect of S-metolachlor contamination on activity of soil dehydrogenase

由图2可知，低浓度(1～3 mg/kg)处理组在试验期内酶活性基本与对照持平；中、高浓度(6～12 mg/kg)处理组对脱氢酶活性的影响呈现激活-抑制-恢复-激活的变化过程。试验进行1周时，6～12 mg/kg各处理对土壤过氧化氢酶活性表现为与浓度成正比的激活作用，培养3 d时达到最大值，6、9、12 mg/kg处理的激活率分别为3.72、5.50、5.99%，均显著高于对照水平。14 d时各处理均表现出与浓度成正比的抑制作用，且中高浓度(6、9、12 mg/kg)处理组的抑制作用达到最峰值，抑制率分别为6.33、7.45、9.12%。试验两周后抑制作用逐渐减弱，3 mg/kg处理组的酶活性在30 d时恢复至对照水平，在45 d时各处理组的酶活性受到第二次激活，该状态一直持续到试验结束。

2.1.3脲酶 如图3所示，低浓度(1～3 mg/kg)精异丙甲草胺对土壤脲酶活性的影响表现为先激活、后恢复、再激活的变化趋势，中等浓度(6 mg/kg)、高浓度(6～12 mg/kg)处理土壤脲酶活性的变化则表现为先抑制、后恢复或再激活。培养第1周时，低浓度(1～3 mg/kg)处理对脲酶活性均表现激活作用，2周后激活作用逐渐降低，45 d时作用消失，脲酶活性与对照持平。中等浓度(6 mg/kg)和高浓度(9～12 mg/kg)处理土壤的脲酶活性表现为持续抑制，在7 d时抑制作用达到最大值，中、高(6、9、12 mg/kg)浓度处理组的抑制率分别为5.98、8.62、12.02%。处理1周后抑制作用逐渐减弱，6、9和12 mg/kg精异丙甲草胺处理土壤的酶活性分别在14 、21和30 d时恢复至对照水平，并分别于30、45和60 d时略高于对照水平。

图3 精异丙甲草胺对烟田土壤脲酶活性的影响Fig.3 Effect of S-metolachlor contamination on activity of soil urease

2.1.4土壤磷酸酶

图4 精异丙甲草胺对烟田土壤磷酸酶活性的影响Fig.4 Effect of S-metolachlor contamination on activity of soil phosphatese

由图4可知，除12 mg/kg处理组外，其余浓度精异丙甲草胺处理对土壤磷酸酶活性的影响均呈现抑制-恢复-激活的规律，12 mg/kg处理组的磷酸酶活性表现为先抑制、后恢复的趋势。在试验第1周，各处理对土壤磷酸酶活性均表现出与浓度成正比的抑制作用，在7 d时抑制效应达到最大，4个处理组的酶活性分别为对照的98.31、93.22、93.78、84.19、75.14%。试验2周后，各处理的抑制作用呈现减弱趋势，其中1 mg/kg处理组的酶活性在整个试验期内基本与对照持平，3、6 mg/kg处理组的酶活性在14、21 d恢复至对照水平，分别于21、30 d高于对照组，9、12 mg/kg处理组的磷酸酶活性在45、60 d恢复到对照水平，9 mg/kg处理组的酶活性在60 d时高于对照组。

2.2 精异丙甲草胺对烤烟植株根际土壤酶活性的影响

2.2.1过氧化氢酶 如图5所示，在整个试验期内，各处理根际土壤的过氧化氢酶活性均高于对照土壤，精异丙甲草胺处理根际土壤的过氧化氢酶活性呈现激活-恢复的变化趋势。在试验前期(1～14 d)，各处理对土壤过氧化氢酶活性均有一定的激活作用，激活作用均在1 d时最为强烈，根际土壤过氧化氢酶活性分别比对照土增加了31.82%，相应的非根际土壤酶活性仅增加25.57%，处理土壤的根际效应R/S为1.14，而对照土壤的根际效应R/S为1.05。第21 d时，激活效应消失，表现为抑制作用，30 d左右精异丙甲草胺对根际与非根际土壤酶活性的抑制作用消失，过氧化氢酶受到第二次激活，且激活效应一直继续到试验结束，但酶活性与对照土壤不存在显著差异(P<0.05)。

图5 精异丙甲草胺对烤烟植株根际与非根际土壤过氧化氢酶活性的影响Fig.5 Effect of S-metolachlor contamination on activity of rhizophere and non-rhizosphere soil catalase

2.2.2脱氢酶

图6 精异丙甲草胺对烤烟植株根际与非根际土壤脱氢酶活性的影响Fig.6 Effect of S-metolachlor contamination on activity of rhizophere and non-rhizosphere soil dehydrogenase

从图6可以看出，在试验的各个时期，无论是对照土样，还是处理土样，根际土的脱氢酶活性均比同期的非根际土壤酶活性要高。精异丙甲草胺处理后，根际土壤脱氢酶活性的变化为激活-抑制-恢复-激活。在试验初期(1～3 d)，土壤脱氢酶活性表现为激活状态，激活作用和根际效应均在3 d时达到峰值，根际土壤脱氢酶活性为对照土壤对108.83%，相应的非根际土壤酶活性为对照土壤的103.72%，根际效应R/S为1.08，差异均达显著水平(p<0.05)。3 d后，处理对脱氢酶的刺激作用逐渐降低，根际与非根际土壤的酶活性均在7 d时恢复至对照水平，在14 d时被显著抑制(p<0.05)，30 d时酶活性恢复至正常水平，45 d时脱氢酶受到第二次激活，且酶活性显著高于对照土壤，并一直继续至试验结束。

2.2.3脲酶

图7 精异丙甲草胺对烤烟植株根际与非根际土壤脲酶活性的影响Fig.7 Effect of S-metolachlor contamination on activity of rhizophere and non-rhizosphere soil urease

由图7可知，在整个试验期间，精异丙甲草胺对土壤脲酶活性的影响呈现先抑制、后恢复、再激活的变化动态。对根际土壤脲酶活性的抑制作用在7 d时达到最大值，处理根际土壤脲酶活性比对照土壤的降低了6.36%，非根际土壤酶活性比对照土壤的降低了5.98%，此时根际效应R/S也达到峰值，为1.09，且相应对照的根际效应与R/S为1.08，均存在显著差异(p<0.05)。7 d后精异丙甲草胺对土壤酶活性的抑制作用逐渐降低，21 d时恢复至对照水平，并在30 d时高于对照土壤。在整个试验期内，无论是处理土壤还是对照土壤，根际土样脲酶活性均要高于非根际土样。

2.2.4磷酸酶 从图8可以看出，培养期间，根际土磷酸酶活性均高于同期的非根际土。在试验前期(1～21 d)，与非根际土壤相似，处理的根际土壤磷酸酶受到抑制，7 d时，抑制效应达到峰值，精异丙甲草胺处理根际土壤的磷酸酶活性为对照土壤的86.29%，相应的非根际土壤酶活性为对照土壤的85.31%，而处理根际土壤酶活性分别为处理非根际土壤的112.58%，即处理土壤的根际效应R/S为1.13，而对照土壤的根际效应R/S为1.11，存在显著差异(p<0.05)。14 d后抑制作用逐渐减弱，在21 d时恢复至对照水平，30 d后酶活性高于对照土壤，60 d时差异达显著水平(p<0.05)。

图8 精异丙甲草胺对烤烟植株根际与非根际土壤磷酸酶活性的影响Fig.8 Effect of S-metolachlor contamination on activity of soil catalase rhizophere and non-rhizosphere soil phosphatese

3 结论与讨论

试验结果表明：精异丙甲草胺对烟田土壤酶活性的影响不仅与土壤酶的种类有关，更取决于精异丙甲草胺的浓度和处理时间。培养前期(1～2周)，除草剂对土壤过氧化氢酶表现出激活作用，对磷酸酶则表现出抑制作用，作用程度均与浓度成正比，当除草剂浓度高时对脲酶活性有抑制作用，浓度范围在9～12 mg/kg时对土壤脱氢酶具有激活作用。培养后期(2周以后)，所测四种酶活性表现为恢复、抑制或激活的变化趋势。因此，土壤过氧化氢酶和磷酸酶可以在污染早期作为表征精异丙甲草胺残留污染的生物活性指标。精异丙甲草胺除草剂在整个试验周期内，无论是处理土壤，还是对照土壤，根际土壤酶活性均高于非根际土，存在明显的根际效应。就土壤酶而言，在污染早期，土壤过氧化氢酶和磷酸酶对精异丙甲草胺较敏感，可以作为表征精异丙甲草胺残留土壤污染的生物活性指标。

其他关于精异丙甲草胺的研究已探明该除草剂对土壤微生物的动态响应也存在明显的根际效应，且真菌为精异丙甲草胺胁迫下的优势种群。但土壤微生物对该除草剂的降解是否存在直接或间接的作用尚不明确，可采用分子手段对该根际土壤中的微生物进行分析，探究起关键作用的种群，进一步探讨精异丙甲草胺在烟田土壤中的降解机理。

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