余丽 晏爱芬 陈瑶

摘 要：试验按L9（34）正交设计，以多糖含量作为多糖提取率指标，对野生美味牛肝菌子实体多糖提取条件（料液比、提取温度、提取时间、乙醇沉淀浓度）进行优化。结果表明，4个因素对野生美味牛肝菌多糖提取率的影响表现为料液比>提取温度大于乙醇沉淀浓度>提取时间，其中料液比和提取温度的影响分别达到极显著和显著水平，确定野生美味牛肝菌多糖提取的最佳工艺为料液比1∶25、提取温度90 ℃、提取时间2 h、乙醇浓度95%。

关键词：美味牛肝菌；野生；多糖；正交试验

中图分类号：S643.3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.12.005

Abstract： The experiment was conducted to optimize the extraction conditions of polysaccharide from Boletus edulis with the orthogonal design L9（34）， 4 conditions were set including material to solvent ratio， extraction temperature， extraction time， and ethanol concentration， the polysaccharide content was used as the index of polysaccharide extraction efficiency. The results showed that the effects of 4 conditions on the polysaccharide extraction efficiency of B. edulis were as follows： material to solvent ratio>extraction temperature>ethanol concentration>extraction time， in which the effects of material to solvent ratio and extraction temperature were significant. The optimum extraction process which screened by the orthogonal experiment was as follows： material to solvent ratio （1∶25）， extraction temperature （90 ℃）， extraction time （2 h）， and ethanol concentration （95%）.

Key words： Boletus edulis； wild； polysaccharides； orthogonal test

美味牛肝菌（Boletus edulis Ball. ex Fr）在1821年由法国科学家皮埃尔发现，并由瑞典科学家Elias Magnus Fries命名[1]，因其肉厚而细软、味道鲜美，富含蛋白质、多糖、纤维素、维生素、矿物质、氨基酸等物质，倍受消费者喜爱，同时是我国重要的出口野生食用菌[2-4]。据报道，美味牛肝菌多糖成分在免疫缺陷性疾病、自身免疫疾病和肿瘤等疾病的临床治疗上具有免疫调节活性作用，因而被称为“生物效应调节剂”[5-8]。这些活性多糖理化性质、提取工艺已成为多糖研究的前沿领域，取得了长足的发展，但有关美味牛肝菌多糖提取条件优化的研究报道较少。

本研究对野生美味牛肝菌多糖含量提取条件进行优化，旨在为多糖高效提取和利用提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

野生美味牛肝菌为市售，并经保山学院微生物学实验室鉴定，子实体洗净、晒干、粉碎后备用；人工美味牛肝菌组织由保山学院微生物学实验室培养，将菌丝培养分化形成的组织晒干、粉碎后备用。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计 干燥的野生美味牛肝菌子实体粉末采用热水提取—乙醇沉淀的方法进行多糖提取，以料液比、提取温度、提取时间、乙醇沉淀浓度为试验因素[5-8]，按L9（34）正交表进行正交试验设计，以野生美味牛肝菌子实体的多糖含量为指标进行多糖提取最佳条件筛选，所用因素和水平见表1。

1.2.2 多糖含量的测定 利用苯酚—硫酸法，分别制备浓度为0， 0.04， 0.08， 0.12， 0.16， 0.20 mg·mL-1葡萄糖标准溶液，按“标准溶液1.6 mL+蒸馏水2.4 mL+苯酚2 mL+浓硫酸10 mL”配比混匀后，用分光光度计在490 nm处测定吸光值，制作标准曲线；以正交试验各处理提取出的多糖提取液1.6 mL替代葡萄糖标准溶液，其他成分不变，测定490 nm吸光值，根据标准曲线计算多糖含量，作为衡量野生美味牛肝菌多糖提取率的指标。

1.3 数据处理与分析

通过SPSS19.0软件对试验结果进行正交统计分析[9-12]。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线如图1所示，线性回归方程为y = 3.357 1x-0.022，R2= 0.995 5，符合试验要求，可通过线性回归方程转换得到1 g美味牛肝菌中的多糖含量。多糖含量m=CV，其中C为提取液中多糖质量浓度，V为提取液的总体积，则多糖含量计算公式为：m=（y+0.022）/3.357 1×V。

2.2 4种因素对野生美味牛肝菌多糖提取率的影响

根据表2中T值和表3中的F值可知，4个因素对野生美味牛肝菌多糖提取率的影响顺序表现为：料液比（A）>提取温度（B）>乙醇浓度（D）>提取时间（C），其中因素A和B对多糖提取率的影响分别达到极显著（P<0.01）和显著水平（P<0.05）；根据表1中的极差R可知，因素A、B、C、D分别以A2、B3、C1、D3水平多糖提取率最高，说明正交试验筛选4个因素的最佳组合为A2B3C1D3，即料液比1∶25、提取温度90 ℃、提取时间2 h、乙醇浓度95%；由表3中A+B+C+D处理的F值可知，4个因素对野生美味牛肝菌多糖提取率的总体效益显著（P<0.05），其中以A3B3C1D2，即料液比1∶30、提取温度90 ℃、提取時间2 h，乙醇浓度90%时，提取率最高，这与正交试验筛选的最佳组合A2B3C1D3不一致，故其最佳提取工艺有待于进一步进行验证。

3 結论与讨论

本试验中，4个因素对野生美味牛肝菌多糖提取率的影响由高至低依次为料液比（A）、提取温度（B）、乙醇浓度（D）、提取时间（C），其中料液比和提取温度的影响达显著水平；根据正交试验结果筛选4个因素的优水平为A2B3C1D3，即料液比1∶25、提取温度90 ℃、提取时间2 h、乙醇浓度95%，其中料液浓缩时间的延长会破坏多糖结构，致使多糖损失率增加，故其优水平为1∶25，而提取温度和乙醇浓度分别以高温和高乙醇浓度效果较好，可加快分子动力，利于细胞膜解离多糖渗出。但因优水平与正交试验9个处理中效果最佳的组合A3B3C1D2即料液比1∶30、提取温度90 ℃、提取时间2 h、乙醇浓度90%不一致，故野生美味牛肝菌多糖提取效果的验证试验有待于进一步开展。

参考文献：

[1]张园园，张晶，王勇，等.美味牛肝菌研究现状及开发前景[J].食用菌，2017，39（2）：1-4， 9.

[2]应建浙，卯晓岚，马启明，等.中国药用真菌图鉴[M].北京：科学出版社，1987：371.

[3]林晓民，李振岐，侯军.中国大型真菌的多样性[M].北京：中国农业出版社，2005：120-134.

[4]王茂胜，连宾.美味牛肝菌研究[J].贵州林业科技，2003，31（3）：34-38.

[5]杜敏华，张英君，刘明星，等.野生牛肝菌多糖提取工艺的优化及其对自由基的清除作用[J].食品工业科技，2012，33（22）：292-295， 302.

[6]李世敏，刘冬.金针菇多糖提取新工艺的优化[J].食品与发酵工业，2002，31（10）：45-48.

[7]杜庆.食（药）用真菌多糖的研究进展[J].中国食物与营养，2011，17（5）：75-77.

[8]王雪冰，赵天瑞，樊建.食用菌多糖提取技术研究概况[J].中国食用菌，2010，29（2）：3-6.

[9]张荣山.药物分析中正交试验数据的统计分析[J].张家口医学院学报，2000，17（4）：8-9.

[10]王兴仁，张录达，王华方.正交试验设置重复的必要性和统计分析方法[J].土壤通报，2000，31（3）：135-139.

[11]刘金发，龚一珍，李枝端.Excel在L8（27）正交试验数据处理中的应用与SPPS的比较[J].海峡药学，2009，21（6）：38-39.

[12]杜荣骞.生物统计学[M].北京：高等教育出版社，2003：1-282.