夏 军, 章 茜, 袁丽亚, 王新风, 徐继明

(1.淮阴师范学院 化学化工学院, 江苏 淮安 223300; 2.淮阴师范学院 生命科学学院, 江苏 淮安 223300)

0 引言

甘薯在江苏省淮安市有300多年的栽培历史,既是传统的粮、饲兼用作物,又是目前具有明显区域生产优势的专用经济作物,年种植面积稳定在两万公顷左右[1]．以甘薯为原料加工粉丝是当地一项重要经济产业,据统计,淮安市境内有淮阴区赵集粉丝厂和洪泽县西顺河粉丝厂两家龙头加工企业,中小型加工粉丝企业105个,甘薯加工专业户近千个,粉丝的年供应量达5 000吨左右．甘薯加工为粉丝后,遗留下大量薯渣,由于薯渣有机质和水分含量高,容易腐败变质产生恶臭气味,粉丝加工厂通常将其作为废渣作掩埋处理,导致土壤和地下水的严重污染,加重了当地农业面源污染．

除了做掩埋处理,当前处理薯渣的一个可行方法是将其作为饲料饲喂畜禽．然而,由于薯渣中纤维素含量高,蛋白含量低,直接用作饲料,适口性差．此外,薯渣储存过程中可能被病原微生物污染变质,将其饲喂牲畜存在致使畜禽患病死亡的可能[2]．因此,薯渣直接饲喂禽畜可谓弊端重重．近年来,通过微生物发酵技术,将废弃薯渣转化为菌体蛋白饲料,成为薯渣资源化利用的一条重要途径[3]．微生物发酵技术改变了薯渣原来的物理化学性质,将其所含的粗纤维降解为单糖、多糖、氨基酸等小分子物质,细菌、酵母菌等利用这些营养物质大量繁殖菌体,菌体蛋白就是从酵母或者细菌等微生物菌体中获取的蛋白质．目前相关研究已见诸报道,如Aziz等以甘薯渣的酸水解液为底物,接种串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的混合菌进行固态发酵,发酵3天后,薯渣中的菌体生物量达13.96 g/L[4]．汤燕花、谢必峰等使用啤酒酵母和黑曲霉的混合菌固态发酵木薯渣,薯渣蛋白含量由3%～4%提高至15%左右,氨基酸总量提升至5.2%[5]．微生物细胞中含有丰富的蛋白质,例如酵母菌蛋白质含量占细胞干物质的45%～55%;细菌蛋白质占干物质的60%～80%[6]．因此,应用微生物发酵技术可对薯渣进行深度生化加工,提高薯渣饲料的消化吸收率．

以薯渣为原料制备菌体蛋白饲料,虽然蛋白质含量得到较大提高,但是由于菌体蛋白是由植物性原料发酵转化而来,这些植物性的菌体蛋白(大豆除外)中必需氨基酸的含量极低,如赖氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸等．研究表明,如果蛋白饲料中长期缺乏某一种或几种必需氨基酸,会使畜禽生长停滞,体重下降,降低饲料中其他成分的利用率,因此,合理调节饲料中氨基酸配比,对促进畜禽生长发育,提高饲料利用率具有重要意义[7]．一般认为,赖氨酸是玉米-豆粕型粮食的第一限制性氨基酸[8]．味之素动物营养集团于1999～2001年对全球21个国家379个具有代表性的猪饲料中赖氨酸和粗蛋白含量进行化验分析,结果表明各国饲料的蛋白质含量差异不大,但是我国饲料赖氨酸含量明显偏低[9]．赖氨酸是影响机体代谢、生产性能和饲料成本的核心因素之一,其在畜禽体内最重要的作用是合成体蛋白(如肌肉蛋白)、各种酶类以及多肽激素等.

本文以废弃薯渣为底物,在常规发酵菌株中添加赖氨酸产生菌株进行固态发酵,开展混菌发酵制备富含赖氨酸的菌体蛋白饲料的研究,目的是提高菌体蛋白饲料中第一限制氨基酸赖氨酸含量,降低蛋白饲料的生产成本,为薯渣废弃物的资源化利用提供可行的途径．

1 材料与方法

1.1 菌株和发酵原料

瑞氏木霉Trichoderma reesei HA-1和北京棒杆菌Corynebacterium pekinense HA-3C,由淮安百麦绿色生物能源有限公司提供．产朊假丝酵母Candida utilis,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC No.1807)．甘薯渣为淮安市赵集粉丝厂生产粉丝的废渣,简单清洗后晒干,粉碎过20目标准筛备用．

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基

瑞氏木霉HA-1保存于PDA培养基,产朊假丝酵母1807保存于YPD培养基,北京棒杆菌HA-3C保存于LB培养基．

1.2.2 子培养基

种子培养基A:葡萄糖10 g/L,酵母粉1 g/L,KH2PO42 g/L,(NH4)2SO41.5 g/L,尿素 0.3 g/L,CaCl20.4 g/L,MgSO40.3 g/L,FeSO45 mg/L, MnSO41.5 mg/L, ZnSO41.5 mg/L, CoCl22 mg/L．种子培养基B:YPD液体培养基．种子培养基C:葡萄糖20 g/L,酵母粉5 g/L,(NH4)2SO45 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO40.5 g/L,pH 7.0．

1.2.3 固态发酵培养基

薯渣50%,麸皮50%,作为发酵基质．以发酵基质100%为基准,加入糖蜜5%,豆饼浸粉3%,(NH4)2SO41%,KH2PO40.2%,MgSO40.05%．基质初始含水量70%,自然pH值．

1.3 发酵方法

1.3.1 摇瓶种子的制备

在250 mL三角瓶中加入50 mL种子培养基,灭菌．将瑞氏木霉HA-1接种于种子培养基A,30℃,200 5rpm培养48 h．将产朊假丝酵母1807接种于YPD液体培养基,30℃,200 rpm培养24 h．将北京棒杆菌HA-3C接种于种子培养基C,30℃,200 rpm培养48 h．

1.3.2 固态发酵

在250 mL三角瓶中加入固态发酵培养基,其中基质15 g．将瑞氏木霉HA-1种子液接种到固态发酵培养基中,48 h后接种产朊假丝酵母1807和北京棒杆菌HA-3C,30℃发酵120 h．总接种量15%(v:w),接种体积比为瑞氏木霉HA-1:产朊假丝酵母1807:北京棒杆菌HA-3C=2:1:2．

1.3.3 正交优化实验

使用正交方法设计实验,进行3因素3水平正交实验,基质比例(A)、糖蜜浓度(B)和豆饼浸粉浓度(C)．A因素的3个水平分别为3/7,5/5和7/3；B因素的3个水平分别为3%,5%和7%；C因素的3个水平分别为1%,2%和3%．正交实验在250 mL三角瓶中进行,发酵条件同上．

1.4 分析方法

1.4.1 发酵产物中的粗蛋白含量

取发酵产物适量,用蒸馏水洗涤3次,离心弃上清液,以去除其中的无机氮,沉淀物采用凯式定氮法(GB/6432-94)测定总氮含量,总氮含量乘以6.25,即得粗蛋白含量．

1.4.2 发酵产物中的赖氨酸含量

取发酵产物适量,加入10倍体积去离子水,200 rpm,30℃摇床震荡30 min,取上清用高效液相色谱法测定赖氨酸含量．色谱柱:Hypersil AA-ODS column(2.1 mm×200 mm,Agilent Technologies,USA),柱温40℃,流速0.45 mL/min,338 nm紫外检测．流动相:20 mmol/L乙酸钠和0.018%三乙胺的水溶液,用1%～2%乙酸调节pH至7.2,此为流动相A;100 mmol/L乙酸钠,1%～2%乙酸调节pH至7.2,然后加入两倍体积的乙腈和2倍体积的甲醇,此为流动相B．将邻苯二甲醛作为柱前衍生剂,将邻苯二甲醛与待测样品在缓冲液中混合反应,然后进样色谱柱进行分析,柱前衍生由高效液相色谱仪完成．以A相和B相的混合液作为流动相,B相初始体积比为0,随后逐渐上升至100%,梯度洗脱．

2 结果与讨论

2.1 基质组成和外源添加物对固态发酵的影响

研究中利用霉菌将薯渣中的木质纤维素降解为单糖,供酵母菌和北京棒杆菌使用,考虑到薯渣中容易被微生物直接吸收利用的营养成分含量较少,可能无法满足酵母菌和北京棒杆菌菌体增殖的需要,因此需要外源添加营养成分．另一方面,甘薯渣吸水性较强,作为固态发酵唯一基质,会导致氧气和水分流通困难,因此将薯渣与麸皮复配作为发酵基质．考察结果如图1所示,外源添加的几种碳源(添加量5%)中,葡萄糖添加后发酵产物粗蛋白含量最高,达到11.3±0.4%,添加糖蜜发酵后赖氨酸含量最高,达到0.86±0.03%．考虑到添加糖蜜后,发酵产物粗蛋白含量与添加葡萄糖相比相差不大,并且糖蜜的价格要比葡萄糖低,因此选择糖蜜作为外源添加的碳源．

在外源添加的几种氮源(添加量2%)中,添加蛋白胨和酵母粉效果最佳,相比之下,添加豆饼浸粉后发酵粗蛋白含量9.7±0.3%,赖氨酸含量0.72±0.05%,虽然效果不是最佳,但是与蛋白胨和酵母粉相比差距不大,并且豆饼浸粉的价格较为低廉,因此选择豆饼浸粉作为外源添加氮源．

考察了不同比例的薯渣:麸皮作为基质(不添加碳源和氮源),对固态发酵的影响,结果显示基质的构成对实验结果具有重要影响．当薯渣：麸皮比例(w：w)为5：5时效果最好,发酵产物中粗蛋白含量4.6±0.3%,赖氨酸含量0.35±0.02%．

2.2 正交试验优化固态发酵培养基组成

根据单因素考察的实验结果,进一步开展了基质组成、碳源和氮源的正交试验,以优化固态发酵培养基组成,按照3因素3水平设计正交试验表,结果如表1所示,极差分析结果见表2．

表1 正交试验设计及结果

表2 极差分析表

图1 外源添加碳源(a)、氮源(b)以及基质组成(c)对固态发酵的影响

根据极差R判断,对于粗蛋白含量这一指标,因素的影响力大小顺序为A>C>B,通过K值判断最大粗蛋白含量对应的最适条件为A2B2C3．对于赖氨酸含量这一指标,因素的影响力大小顺序为A>B>C,最大赖氨酸含量对应的最适条件为A2B3C1．研究使用正交优化的目的,是发酵产物中粗蛋白含量和赖氨酸含量同时取得较高水平,最大粗蛋白含量和赖氨酸含量均是对应于A2,因此A因素取第2水平;B因素在第2、第3水平之间选择,考虑到取B2水平时蛋白质含量平均值10.3%,赖氨酸含量平均值0.75%,取B3时蛋白质平均值9.67%,赖氨酸平均值0.84%．两种情况下赖氨酸含量变化不大,若取B3,蛋白质损失较大,故B因素取第2水平比较合适,同理,C因素取第3水平．因此,正交优化条件为A2B2C3,在此条件下进行发酵实验验证,发酵产物中粗蛋白含量为13.0%,赖氨酸含量0.87%,较优化前显著提高．

2.3 固态发酵培养条件优化

2.3.1 接种比例对混菌固态发酵的影响

为了进一步提高混菌固态发酵产物中粗蛋白和赖氨酸含量,根据前期单因素实验和正交试验结果,对固态发酵培养条件进行优化．首先对种子液中各个菌种的接种比例(v:v)进行了优化,结果如图2所示,当种子液中霉菌、酵母菌和北京棒杆菌最优体积比为2:1:2,此时薯渣发酵后粗蛋白含量达到14.3±0.3%,赖氨酸含量为0.96±0.06%．原因可能是,霉菌的作用是分解薯渣中的木质纤维素为单糖,因此接种较多的霉菌可以为酵母菌和北京棒杆菌提供充足的碳源．

2.3.2 接种量对混菌固态发酵的影响

接种量对于固态发酵具有重要影响,合适的接种量可以保证菌体的快速增殖,然而,过高的接种量则会导致菌体生长过快,抑制产物合成[10]．研究考察了接种量6%～21%(v:w)对混菌固态发酵的影响,如图3所示,最优接种量为15%(v:w),薯渣发酵后粗蛋白含量达到15.5±0.5%,赖氨酸含量为1.12±0.04%．

2.3.3 基质含水量对混菌固态发酵的影响

考察了基质含水量对固态发酵的影响．含水量也是固态发酵中一个重要影响因素,基质含水量过高,会对固态发酵过程中氧气传递产生阻碍,含水量过低,则会影响基质中营养成分的扩散传递[11]．研究考察了含水量50%～75%(v:w)对混菌固态发酵的影响如图4所示. 最优含水量为70%,薯渣发酵后粗蛋白含量达到16.8±0.4%,赖氨酸含量为1.32±0.06%．

图2 接种比例对固态发酵的影响 图3 接种量对固态发酵的影响

图4 含水量对固态发酵的影响

3 结论

以废弃薯渣为原料,以瑞氏木霉、产朊假丝酵母和北京棒杆菌混菌进行固态发酵,生产富含赖氨酸的菌体蛋白,为实现甘薯渣资源化利用、解决废弃薯渣引起的环境问题提供新的思路．研究对固态发酵发酵培养基组成和培养条件进行了优化,得到以下结论:

1) 向薯渣中添加麸皮作为发酵基质,同时外源添加价格低廉的糖蜜和豆饼浸粉,可以显著提高固态发酵产物中粗蛋白和赖氨酸含量．正交实验结果显示,基质组成、糖蜜添加量、豆饼浸粉添加量3个因素中,基质组成对发酵产物中粗蛋白和赖氨酸含量的影响最大．正交实验优化后的培养基中,薯渣与麸皮比例(w:w)为5:5,糖蜜添加量5%,豆饼浸粉添加量3%．

2) 进一步对固态发酵的培养条件进行优化,当种子液中霉菌、酵母菌和北京棒杆菌的最优体积比为2:1:2,总接种量15%(v:w),基质含水量为70%时,薯渣发酵后粗蛋白含量达到16.8%,赖氨酸含量为1.32%,较优化前显著提高．

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