刘 琳 ， 姜晓文 ， 于文会 ， 辛 秀 ， 乔 路

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江省 哈尔滨 150030)

血竭、乳香、没药、白芨和三七等是临床上治疗创伤愈合的常用药。近年来此类药的研究越来越深入。血竭专入血分，具有活血化瘀、祛腐生肌、止血止痛的作用，是中医学治疗皮肤创伤的常用药物。李丹[1]等研究表明，通过氯仿、95%乙醇、乙酸乙酯等对血竭进行提纯，得到的乙酸乙酯提取物经一系列的研究证明，它能促进角质细胞的增殖，具有促进创伤愈合中再上皮化的作用。贺选玲[2]等通过龙血竭对糖尿病大鼠溃疡创面愈合的作用机制的研究，发现龙血竭外用对创面愈合的效果要优于胰岛素外用，同时可以下调 Smad3、Smad4 的表达水平。乳香具有活血、止痛、生肌的作用。《本草纲目》中指出，乳香活血，没药散血，能增强活血止痛的功效。两者化学成分也非常相似，主要含有挥发油、树脂和树胶等。其中，挥发油具有镇痛的作用。乳香提取物对雪旺细胞增殖起到一定的促进作用，更好的发挥了雪旺细胞在创伤愈合中神经修复方面的作用[3]。郑杭生[4]等研究了乳香和没药的提取工艺和提取物的镇痛作用，发现醇提后增加了挥发油的镇痛效果。陈德利[5]等研究白芨、地榆、乳香、没药等活血化瘀药对角质形成细胞游走的影响，通过试验发现，没药在一定浓度时对角质细胞的游走有一定的影响，但是乳香对角质细胞游走的影响不显著。

当皮肤发生损伤时，自身会通过一系列生物反应实现自我恢复，该过程主要包括止血、肉芽组织再生和组织重建3个步骤[6]，在这个过程中有很多细胞以及细胞活性因子参与，其中成纤维细胞在此过程中起着至关重要的作用，在早期的伤口愈合过程中，成纤维细胞在创口处大量增殖和转移，同时成纤维细胞合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与毛细血管共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件[7-8]。本次试验通过检测防腐生肌膏对大鼠皮肤伤口愈合的影响，为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 防腐生肌膏的制备 防腐生肌膏由中药血竭、乳香、没药、三七、紫草、黄柏、冰片等组成。具体制备方法如下。首先将血竭和冰片研磨成细粉，过 120 目筛。随后把除血竭、冰片外的其他中药放入麻油内浸泡 48 h。再把浸泡好的药料倒入锅加热至沸，同时不断搅拌，改用文火将药料炸枯，至药料表面呈现深褐色，内部焦黄为止，用纱布将药渣过滤，滤液备用。然后将准备好的凡士林加入滤液中搅拌，待温度降至 60 ℃，把血竭和冰片的细粉加入并不断搅拌，至冷凝为止，灭菌后4 ℃保存备用。

1.2 动物皮肤缺损模型的制备 健康的SD大鼠50只，雌雄各半，体重约200±20 g，常规饲养一周后开始造模。造模前先用10%犬眠宝麻醉大鼠，然后将麻醉后的大鼠俯卧固定，在其背部正中左右两侧距脊柱1.5 cm处各选择一块 5×5 cm 的完整皮肤，用10%硫化钠脱毛，生理盐水洗净擦干局部消毒，采用自体对照法，在大鼠背部设定皮肤右侧为防腐生肌膏组；左侧为空白对照组，用组织剪在脱毛处剪成一直径为 2×2 cm 的伤口，深达肌筋膜，为防止大鼠互相舔蹭、撕咬，动物分笼进行饲养，并给以充足的水和食物。防腐生肌膏组的创面每天进行常规消毒，涂抹防腐生肌膏，厚度约2 mm；空白对照组的创面每日常规消毒，涂抹2%碘酊。

1.3 样本采集 分别于造模后的第3、7、10、14天，随机选取每组各10只大鼠取样，乙醚麻醉大鼠，用剪刀剪取各组大鼠创面中心至创缘正常皮肤间的新生的肉芽组织，约0.5 cm2，置于-80 ℃冰箱中备用，另取部分同样的组织置于4%多聚甲醛中固定备用。

1.4 计算创面愈合率 造模后分别于第3、7、10、14天，观察创面愈合情况，分别拍照，用ADOBE photoshopcs4计算出创面愈合率。创面愈合率=(原始创面面积-残余创面面积)/原始创面面积×100%

1.5 计算创面愈合时间 分别对各组大鼠进行长期观察，记录创面愈合时间。创面愈合时间是以肉芽完全覆盖创面为标准，对于达到创面愈合标准的时间即为创面愈合时间。

1.6 计算创面愈后瘢痕面积 造模后第30天，对各组大鼠剪毛，对愈后创面拍照，用ADOBE photoshopcs4计算创面愈后瘢痕面积。

1.7 创面肉芽组织学观察 将上述采集的样本置于4%多聚甲醛中，进行常规修块，流水冲洗过夜，脱水透明后，用石蜡包埋，连续切片，其中部分用于H.E.染色，另外一部分烘干后保存备用。进行脱蜡放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ 10 min；进入浓度分别为95%、80%、70%酒精中，轻轻上下进出5～6次；用流水冲洗5 min；蒸馏水冲洗5 min，放入苏木素20 min，自来水冲洗片刻；1%盐酸酒精中不断摇动只切片变色后迅速放入流水中10～20 min；放入 0.5%伊红中10 min，水洗片刻；放入浓度分别为70%、80%、95%酒精中，各5 min；放入无水酒精Ⅰ、Ⅱ 10 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ 5 min；用树胶封片进行H.E.染色，用普通光镜观察。

2 结果

2.1 防腐生肌膏加速创面愈合 创伤后第3天，大鼠背部两侧创面均已开始结痂，收缩不明显。创伤后第7天，防腐生肌膏侧创面愈合程度明显好于对照侧，创面平整。创伤后第10天，防腐生肌膏侧部分结痂已经完全脱落，并且创缘周围已有被毛覆盖。创伤后第14天，大鼠背部两侧创口已被新生表皮覆盖，创口收缩明显，防腐生肌膏侧创面面积明显小于对照侧，说明防腐生肌膏能显著促进创面愈合，结果见表1。

表1 两侧对大鼠创面愈合率的影响 (%)

注：右上角标的不同数字，1)代表差异极显著(P<0.01);2)代表差异显著(P<0.05)，下表同

2.2 防腐生肌膏对创面愈合时间的影响 防腐生肌膏侧的平均创面愈合时间极显著低于空白对照侧，说明防腐生肌膏能极显著的缩短创面愈合时间(P<0.01)，加快创伤愈合，结果见表2。

表2 两侧对大鼠创面愈合时间的影响

图1 两侧创面组织学切片图 (H.E.染色×100)

(A1):对照侧第1天创面肉芽组织观察； (A2):防腐生肌膏侧第1天创面肉芽组织观察； (B1):对照侧第3天创面肉芽组织观察； (B2):防腐生肌膏侧第3天创面肉芽组织观察； (C1):对照侧第7天创面肉芽组织观察； (C2):防腐生肌膏侧第7天创面肉芽组织观察； (D1):对照侧第10天创面肉芽组织观察； (D2):防腐生肌膏侧第10天创面肉芽组织观察； (E1):对照侧第14天创面肉芽组织观察； (E2):防腐生肌膏侧第14天创面肉芽组织观察

2.3 防腐生肌膏对创伤愈合后的瘢痕面积的影响

防腐生肌膏侧愈后瘢痕面积极显著小于空白对照侧愈后瘢痕面积(P<0.01)，说明防腐生肌膏能极显著减小愈后瘢痕面积，结果见表3。

表3两侧对大鼠预后瘢痕面积的影响

组别预后瘢痕面积/cm2防腐生肌膏侧0.1123±0.02641)空白对照侧0.1878±0.0240

2.4 创面肉芽组织学观察 图1中H.E.染色结果显示，创伤后第1天，炎症反应明显，对照侧和防腐生肌膏侧创面表皮缺失，真皮水肿，内有大量的炎性细胞浸润、坏死组织及出血，毛囊水肿(见图A1和A2)；创伤后第3天，对照侧可见有大量炎性细胞浸润及出血(见图B1)。防腐生肌膏侧创面局部表皮下轻度出血，皮下组织和筋膜内有少量炎性细胞浸润。同时可见成纤维细胞增生，炎性细胞数量较对照侧少(见图B2)；创伤后第7天，对照侧创面有大量炎性细胞浸润，少量血管和成纤维细胞增生(见图C1)。防腐生肌膏侧创面可见真皮内成纤维细胞和小血管大量增生，并有大量嗜中性粒细胞浸润，损伤部位表皮开始结痂(见图C2)；创伤后第10天，对照侧创面可看到肌成纤维细胞变性坏死，少量成纤维细胞和小血管增生(见图D1)。防腐生肌膏侧创面可见大量成纤维细胞和小血管增生，嗜中性粒细胞浸润，肉芽组织大量生长，痂皮开始脱落(见图D2)；创伤后第14天，对照侧创面可看到有少量肉芽组织生长(见图E1)。防腐生肌膏侧创面真皮内胶原纤维消失，成纤维细胞和小血管大量增生(见图E2)。结果见图1。

3 讨论

皮肤愈合是一个复杂的过程，包括了大量的细胞活动和分子活动，最初的炎症阶段再到表皮成纤维细胞增殖和迁移，最后组织进行重建[9]。创面愈合率和愈合时间往往是评价创口愈合效果的直接标准。在我们的研究中，应用防腐生肌膏后的创口愈合率显著高于对照侧，而且在自体对照中，防腐生肌膏侧在用药18 d后创口已经痊愈，愈合速度远快于对照组，具有显著性差异。在创伤早期的炎性浸润阶段，大量的嗜中性粒细胞会向创面迁移，在H.E.染色结果中显示，创伤初期都有大量的炎性细胞，当用药一段时间后，创面处炎性细胞明显减少，而且伴随更多血管以及肉芽组织的形成。在创伤愈合过程中,毛细血管新生是皮肤创伤愈合的重要条件[10]。因为毛细血管系统是维持动物机体正常代谢的最基本结构,每根毛细血管供给其周围一定范围内组织细胞代谢所需的营养物质和氧气,并带走组织的代谢产物,如乳酸。肉芽组织是皮肤创伤纤维修复的主要组织成分，主要由细胞、细胞外基质及新生毛细血管组成[11]。创面肉芽组织的生长、转归与创面的愈合有着紧密的联系[12]。

4 结论

本试验证明了防腐生肌膏可以促进伤口愈合，并且减少炎症反应。这为临床上创伤的治疗提供了参考和依据。

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