周孝琼 ， 陈洪博 ， 潘灿阳 ， 张 燕 ， 吴兰芳 ， 王 华

(1.龙岩学院生命科学学院 ， 福建 龙岩 364012 ; 2.福建省家畜疫病防治与生物技术重点实验室 , 福建 龙岩 364012)

葎草(Humulusscandens)，又名苦瓜藤、锯锯藤、拉拉秧、五爪龙、大叶龙五爪蛇干藤，为桑科葎草属多年生蔓生性植物。该草喜阴耐寒、耐旱，我国各地均有生长，常生于荒地、废墟、林缘、沟边等地。具有清热解毒，利尿消肿之功效。可用于肺结核潮热，感冒发热，消化系统炎症及腹泻，小便不利，肾盂肾炎，急性肾炎，膀胱炎，泌尿系统结石；外用可治痈疖肿毒，湿疹，毒蛇咬伤等[1]。葎草营养价值丰富，含有蛋白质，矿物质、微量元素、维生素、氨基酸等，具有平衡动物营养，加速动物生长和调节生理机能等作用，且含大量生物活性物质，如多糖、黄酮类化合物、生物碱类，具有天然药物功能，能增强机体的免疫功能，提高抗病力，增强抗应激能力。葎草乙醇提取物具有广泛的药理作用，如抗炎、抗氧化、消除自由基、抗微生物、促进消化、增强免疫等功能[2]。葎草因其生命力强大危害农作物的生长而被称为恶性杂草，至今未作系统的开发利用，造成了资源的严重浪费。在动物生产中用作饲料原料和饲料添加剂，既可缓解饲料原料紧张的问题，又可利用葎草的药用价值，减少抗生素的滥用，提高食品安全性，以满足人们对高品质畜禽产品的需求。本文研究葎草乙醇提取物对小鼠肠道黏膜免疫相关细胞数量的影响，旨在开发利用葎草作为新型资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 昆明系健康清洁级小鼠，公母各半，体重18±2.0 g,由福州吴氏实验动物中心提供。

1.1.2 试验试剂 葎草，采自田野，切碎、烘干备用；实验室自配试剂：H.E.染色液，PAS染色液，MTB染色液。

1.1.3 试验仪器 中药破碎机(P158)；中药磨粉机(M150)；超声波清洗机(KQ-600DV)；旋转蒸发仪(N-1100)；真空冷冻干燥机(ALPHA 2-4 LD)；徕卡切片机(LEICA RM 2016)；组织包埋机(LEICA EG 1150H)；麦克奥迪显微摄影系统(BA310 Digital，CCD:Moticam2506)。

1.2 方法

1.2.1 葎草乙醇提取物的制备 葎草干燥粉碎，过100目筛，准确称量10 g置于广口试剂瓶中，分别用20倍、15倍、10倍量70%乙醇浸泡，首次浸泡48 h后，超声波温度45 ℃，功率80%，分别超声50 min、40 min和30 min，每次用布氏漏斗真空泵抽滤，合并3次滤液，旋转蒸发仪40 ℃～60 ℃回收乙醇，浓缩、离心，取上清液约10 mL，经真空冷冻干燥机冻干备用。

1.2.2 小鼠动物试验 将32只健康小鼠随机分为4组，即对照组、低剂量组(100 mg/kg体重)、中剂量组(200 mg/kg体重)和高剂量组(300 mg/kg体重)，每组8只。小鼠适应性喂养5 d后开始试验，试验组小鼠按体重每天灌胃葎草乙醇提取物生理盐水溶解液，对照组灌胃生理盐水，1次/d，连续灌胃30 d。

1.2.3 样品采集及处理 灌胃30 d后，每组随机抽取5只小鼠，劲椎脱臼处死，剖检，分别取每只小鼠十二指肠中段约5 cm，生理盐水冲洗，浸泡在10%的甲醛固定液中。固定24 h后，取肠中段约1 cm，经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、常规石蜡切片后，分别进行 H.E.、PAS染色和MTB染色。

1.2.4 十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞(IEL)、杯状细胞(GC)、肥大细胞(MC)数量的检测 H.E.染色和PAS染色的切片，选5根最长、完好、走向平直的绒毛，分别显微镜观察计数IEL和GC，计数每 100 个肠黏膜柱状上皮细胞间的淋巴细胞和杯状细胞数量；MTB染色，光镜下计数每根肠管横断面的肠壁全层(包括黏膜及黏膜下层、肌层及浆膜层)的肥大细胞数量[3]。

1.2.5 数据处理与分析 所得数据采用SPSS18.0软件的0ne—WayANOVA法进行方差分析，差异显著后进行Duncan氏多重比较，以P<0.01(差异极显著)，P<0.05(差异显著)作为差异显著性判断标准，结果用平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 各剂量组对上皮内淋巴细胞数量的影响 试验结果见表1和中插彩版图1。

表1 葎草乙醇提取物不同剂量对小鼠十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞数量的影响

注：同行数据肩标大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，含相同字母表示差异不显著(P>0.05)，下表同

由表1可知，葎草乙醇提取物各剂量组与对照组比较，上皮内淋巴细胞数量均增加，但低、高剂量组差异不显著(P>0.05)，中剂量组差异极显著(P<0.01)。中剂量与低、高剂量组比较差异不显著(P>0.05)。

中插彩版图1中箭头所指细胞为上皮内淋巴细胞(IEL)，经H.E.染色后，小鼠IEL以小型淋巴细胞为主，为染色较深的近似小圆点，多分布于上皮的基底膜附近。

2.2 各剂量组上皮内杯状细胞数量的影响 试验结果见表2和中插彩版图2。

由表2可知，葎草乙醇提取物各剂量组与对照组比较，低、中剂量组的杯状细胞数量差异极显著(P<0.01)，高剂量组差异不显著(P>0.05)。中剂量组与高剂量组比较差异极显著(P<0.01)，与低剂量组比较差异不显著(P>0.05)。

表2 葎草乙醇提取物不同剂量对小鼠十二指肠黏膜上皮内杯状细胞数量的影响

中插彩版图2中箭头所指细胞为上皮内杯状细胞(GC)，一般靠近肠腺部位分布集中，靠近绒毛顶端的杯状细胞呈散在分布，经PAS染色后杯状细胞呈紫红色，高脚杯状。

2.3 各剂量组对肠黏膜肥大细胞数量的影响 试验结果见表3和中插彩版图3。

表3 葎草乙醇提取物不同剂量对小鼠十二指肠黏膜肥大细胞数量的影响

由表3可知，葎草乙醇提取物各剂量组与对照组比较，十二指肠黏膜肥大细胞数量均增加，但低、高剂量组差异不显著(P>0.05)，中剂量组差异极显著(P<0.01)。中剂量组与低、高剂量组比较差异不显著(P<0.05)。

3 讨论

3.1 葎草乙醇提取物对小鼠十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞数量的影响 肠上皮内淋巴细胞(IEL)主要位于上皮内基底膜之上的一种特殊的淋巴细胞群体，是肠黏膜免疫系统中最先与外来抗原和病原微生物接触的免疫活性细胞。具有抑制黏膜超敏反应、中和外源细胞毒作用及分泌淋巴因子等多种功能。在肠黏膜的抗感染免疫、保持肠上皮细胞的完整性及调节对外来抗原的免疫应答方面均有重要作用[4]。其数量多少与肠道吞噬抗原能力和杀灭病原微生物效果有关[5-8 ]。因此IEL的数量可以反映小肠局部黏膜免疫屏障的完整及免疫防御功能的完善程度。本试验结果显示，葎草乙醇提取物组十二指肠绒毛上皮内淋巴细胞均高于对照组，低剂量组提高12.66%，中剂量组提高53.07%，高剂量组提高26.21%，尤以中剂量组最为显著(P<0.01)，结果表明葎草乙醇提取物中剂量能增加小鼠十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞数量，增强免疫能力。这与石玉祥[9]、唐秀莹[10]等人的研究结果较为一致。

3.2 葎草乙醇提取物对小鼠十二指肠黏膜上皮内杯状细胞数量的影响 杯状细胞(GC)是混在黏膜上皮中的黏液分泌型细胞，底部狭窄，顶部膨大，充满黏原颗粒，H.E染色为蓝色或空泡状，多为空泡状。PAS染色使杯状细胞呈现突出而鲜明的红色易于观察。肠道杯状细胞主要分泌黏蛋白(MUC)、肠三叶因子(ITF)和抵抗素样分子β(RELMβ)等成分，这些分泌黏液构成肠道表面覆盖的一层保护性黏液屏障，是肠道固有免疫第一防线的重要组成部分。杨秀娟研究发现，中药复方制剂，能显著提高断奶仔猪小肠黏膜上皮间的杯状细胞数量[11]，闫金坤研究发现给应激小鼠灌服中药提取物可以提高小肠黏膜GC数量[12]。本试验结果表明，低、中剂量葎草组十二指肠绒毛杯状细胞数量显著高于对照组和高剂量组，低剂量组提高46.02%，中剂量组提高51.86%，其中中剂量组差异最为显著，说明葎草乙醇提取物能诱导小鼠十二指肠绒毛杯状细胞数量及分泌黏液增多，在肠道黏膜构成很好的黏膜机械屏障，对机体肠黏膜起到较好的保护作用。

3.3 葎草乙醇提取物对小鼠十二指肠黏膜肥大细胞数量的影响 肥大细胞(MC)是胃肠道黏膜免疫系统的重要组成成分之一，是一种天然免疫效应细胞，受到刺激活化后分泌多种介质参与黏膜免疫调节过程，以增强机体对病原菌的清除能力。有研究发现，肉仔鸡经口注入黄芪多糖可使十二指肠MC数量增多[13]；给小鼠饲喂大蒜溶液可增加肠道中MC数量[14]。本试验结果表明，给小鼠灌胃葎草乙醇提取物可增加十二指肠黏膜中的MC数量，低剂量提高7.10%，中剂量提高33.73%，高剂量提高18.34%，中剂量(200 mg/kg体重)的效果优于低、高剂量,使肥大细胞能更迅速的发挥其免疫调节作用，提高机体的免疫力。

4 结论

肠道黏膜免疫系统是肠道屏障的重要组成部分，与肠道上皮细胞相互作用、相互影响， 保护肠道免受细菌、病毒等微生物的粘附和入侵及防止异物的吸收，起到机体第一道防线的作用。而肠道屏障作用主要由IEL、GC和MC等免疫细胞和细胞因子来完成[15-16]。本试验研究结果为葎草乙醇提取物能够提高小鼠十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞、杯状细胞和肥大细胞的数量，进一步增强肠道的黏膜免疫，保护了肠道的完整性与稳定性，增强机体抵抗力，提高免疫力，为葎草的开发利用提供了科学的理论基础。

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