常见微生物快速检测技术

2018-01-08张子通张爱亮陈启悦上海市计量测试技术研究院

上海计量测试 2017年6期

张子通张爱亮陈启悦 / 上海市计量测试技术研究院

常见微生物快速检测技术

张子通张爱亮陈启悦 / 上海市计量测试技术研究院

0 引言

微生物技术是人类21世纪三大科技革命之一，其对食品、医学、材料等诸多领域都有着深远的影响。作为微生物技术的基础，微生物检测技术的重要性不言而喻。微生物检测的对象有细胞（细菌、单细胞生物、低等藻类等）及病毒，检测指标包括数量、类别，较高要求的会涉及细胞的活性状态等方面。

涂布法是传统的微生物检测方法。现行国家标准GB 4789-2016《食品微生物检测方法》的主体内容就是一系列涂布方法：即在达到洁净要求的实验室里对样品进行溶解稀释，然后将不同比例稀释的样品液涂于相应培养基表面，必要时取空白基参照，恒温（一般是 35～37 ℃）培养一段时间（一般是 1～3 d）后进行菌落计数，其中计数可行有效的稀释样品用于计算原始样品的浓度；依所测指标，试剂、器材、实验条件亦会相应调整。GB 4789-2016系列标准于2017年正式生效，代替了GB 4789-2010。虽然冠以“食品”之名，GB 4789-2016总则及其包含的各单独方法对不同行业的微生物检测都具有较高的指导性和代表性。譬如对于更严苛的药品检测，操作流程类似，但实验室要求更高，同样的指标培养时间一般会更长（5～7 d）。

随着经济的发展，市场对微生物检测的时效性和精密分析能力提出了较高要求，如：对食药、生化流水线产品品质的即时监控；执法部门、海关对样品执法、通关检测；高端生化行业对特定菌种的大批量、高精度检测。在这些诉求面前，经典的涂布法在对实验室要求高（包括硬件、环境、种类试剂耗材的采购制备）、对人员专业性和人数要求高、样品培养时间长、无法检测病毒等方面，其局限性日益显现，故微生物快速检测方法和仪器（以下简称速测方法、速测仪器）应运而生。从21世纪初开始到现在，不同原理的速测方法都已经取得了长足的进步，目前常见的仪器在可靠性、动作机构等方面已经比较成熟，应用的范围也各自确立了。

新版GB 4789-2016整合了部分快速检测方法。比如《PCR荧光法检测诺如病毒》（GB 4789.42-2016，替代了原来只适用于贝类的SN/T 1635-2005《贝类的诺沃克病毒检测方法》），填补了涂布法无法检测病毒空白。在许多特定微生物检测项目中，新标准也使用了PCR方法在涂布后用来确认物种。可以说，我国对微生物的检测在国家层面上也已经顺应时势进行了自我完善，PCR方法作为菌种判定和病毒检测的标准方法的地位基本确立。

随着速测方法在各个方面的应用越来越广泛，相关仪器的计量工作也势在必行。目前国家尚无对此类仪器的统一的计量校准标准，非常重要的一个原因是因为仪器的种类丰富、原理各异、应用条件也不同。故本文对常见的速测方法的原理特点、主要应用领域进行概括归纳，既可以为未来的计量工作整合信息，同时在开展微生物速测工作时，对方法的选用，也可以提供一些建议和参照。

1 常见微生物快速检测方法

1.1 快速测试卡（套装）

快速测试卡（套装）是对涂布方法通过技术手段尽可能简化步骤来达到提速的一种微生物速测方法。这种方法技术成熟，成本低廉，携带方便，非常适合常见指标的现场检测。该方法将实验室培养基用含有营养物质的预制“取样-保存-培养”一体化的压片、纸卡或小型容器替代，取样涂布同时进行，取样后的预制载体或直接用于培养，多无需稀释，减轻了现场采样和实验室检测的工作量，并且试图通过改良培养物质以求缩短某些指标的培养时间，但一般依旧难以短于12 h。

同时，亦有根据行业标准或其他特定需求专用的试纸型器材。这类器材通过色差，可定性表现或粗略定量地表现某些指标。其原理与涂布法稍有不同，多是通过特征菌与特定物质反应显色而非涂布计数，但大多依旧无法绕开培养时间长这一瓶颈。其中比较典型的有餐具大肠杆菌专用试纸，其根据GB 14934-2016《消毒餐(饮）具》所述，在定性分析餐具大肠杆菌存否这一指标上和GB 4789.3-2016《大肠杆菌测试方法》等效。

1.2 聚合酶链反应方法（Polymerase Chain Reaction，简称PCR方法）

PCR方法是一种比较快速的精密微生物检测方法，其原理是利用DNA在95 ℃时变性成单链，低温60 ℃左右时，引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再升温至72 ℃左右，DNA聚合酶在此最佳活性温度沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。由于原理上其直接复制目标碱基配对，故可非常准确地测量某一特定微生物种的数量。然而其存在假阳性概率较高的问题，原因是已死微生物的DNA链也会被检出，所以排除干扰是实验设计中的重要一环。此法可用于检测病毒，国标中收录的有GB 4789-2016.42《食品微生物检测标准荧光法检测诺如病毒》，还有在禽流感流行时期催生的GB/T19438.1-2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》等。目前GB 4789-2016里所涉及的PCR方法主要为PCR荧光法，即对培养得到的碱基透过荧光物质染色然后定量分析的做法。

除了与其他微生物检测方法类似的注意点以外，由于此方法所涉及的生物反应对温度极度敏感，所以温控准确是保障检测可靠性的必须条件，故多作为实验室的固定设备。目前存在用户通过对温控系统的校准来辅助判断仪器可靠性的做法。

1.3 腺苷三磷酸荧光法（Adenosine Triphosphate Fluorescence，简称ATP荧光法）

ATP荧光法的基本原理是通过萤火虫荧光素酶（简称虫光素酶）催化萤火虫荧光素（简称虫荧光素）与生命体中常在能量物质腺苷三磷酸在有氧状态下发生氧化还原反应发光。当虫光素酶和虫荧光素在体系中处于过量情况下，发光强弱取决于ATP 数量。只要排除非检测项目因素的ATP，则可以通过发光强度直接求得目标量的数值。因此ATP法在应对复杂的情况或是用于检测特定项目时，需要追加前处理，一般较涂布法的培养基或是培养过程调整来说容易。如伍季等将此技术用于啤酒菌落总数的检测：啤酒中含有其他有机活性物质，他们通过追加了减压过滤富集装置，降低了啤酒中酶抑制剂和发光干扰的影响，达到的检测线可达到10-15ATP，即相当于103cfu的菌落。

ATP法检测速度一般为15～30 min，对现场要求比较低，无需培养，步骤少，误操作、无效数据易被发觉，设备也已经小型化，较之速测套装依旧需要等待培养时间以及只能检测基础指标，可谓优势明显，而且操作上，“取样-仪器-读数”的用户体验也更符合当代人操作习惯，故ATP技术是目前各技术中比较有潜力发展成“傻瓜”型民用或执法用便携产品的速测仪器。

1.4 流式细胞计数法（Flow Cytometer，简称FCM）

流式细胞计数法是基于细胞直接计数的一种微生物快速检测方法，其基本原理是样品流经小孔时，检测由于细胞存在而改变的环境参数，比如电传导差、光散射、荧光标记，进而可以获得细胞大小、数量等信息。结合其他条件，可以进行诸如病菌种类、细胞死活状态等精密分析，已经成为专业生物实验室的重要装备。流式细胞计数装置一般由五大部分组成：液流系统、光学系统、信号收集与转换系统、分析系统。经过数年的发展，该系统已经进入到了微生物检测的各个领域，以荧光标记为主要信号采集方式。该检测方法速度较快，约为15 min，若进行连续批量操作，单个的平均时间更短。

除了用于精密分析，在批量分析的应用中，流式细胞技术凭借其大批量以及在线处理能力所连带的总成本下降，也具有一定优势。并且利用其原理上便能判断细胞死活的特性，是常见速测方法里假阳性概率最低的方法。另外，流式细胞技术的应变能力很强，在已经有主体设备的情况下，如果需要拓展、改变检测项目，流式细胞仪器往往只需要调整检测程序，配合改变相应的耗材即可，这使得该仪器实际利用率很高，尽管初期投入较大，不少企业依旧乐意使用。

1.5 阻抗法

微生物的活动会产生大分子电化学惰性物质与小分子电化学活性物质，可利用其对周遭电化学性质的变化检测微生物的数目。目前比较成熟的是阻抗法，即测量体系阻抗变化来推算微生物指标。

这种方法原理经典成熟，仪器自身廉价，敏感度、可靠性、重复性都较好。该方法不需要对样品进行复杂的前处理，因而在线检测容易实现。其主要缺点在于其本质只是检测阻抗，而影响阻抗的因素非常多，其中不乏很多非生物性的因素，所以其检测往往需要在某个固定环境下，阻抗变化才会和微生物的多少有关。张爱萍等对牛奶的菌落总数使用阻抗法进行检测的试验中，其检测对象就是某特定批次的牛奶产品，其实验结果充分说明了阻抗法在固定工况下检测的优势。由于多用于检测环境相对固定的诸如生产线监测，其计量也必须是现场或是在线的校准。脱离工况状态的校准只能判断仪器功能的完整性，对于使用方并无意义。

2 结语

就本文所介绍的五种常见的微生物速测方法，这些方法各有所长，特点归纳到表1。

表1 常见微生物快速检测方法归纳

总体来说，目前生物速测方法经过十几年的发展，各种技术都日趋成熟，在各自应用上的准确度、可靠性上也都经过了实践检验，选择上以任务特点导向为主，每个方法互为补充，不存在替代关系，更多是如同GB 4789-2016一般整合搭配使用，从而做到取长补短以提高总体的检测质量及能力。但对每种仪器的使用方法来说，未来如何寻求一个统一可行的标准来公证地校准不同速测仪器将会是计量工作的一个主要问题。

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