赵雪峰,王 艺,许广大

(大连大学附属新华医院 普通外科，辽宁 大连 116021)

论著

小鼠梗阻性结肠癌模型的建立与稳定性分析

赵雪峰,王 艺,许广大

(大连大学附属新华医院 普通外科，辽宁 大连 116021)

目的探讨建立小鼠梗阻性结肠癌模型的方法，并验证其稳定性。方法将50只BALb/c小鼠随机分成25只梗阻性结肠癌模型组(研究组)和25只PBS替代癌细胞模型组(对照组)，制模后各组小鼠再分成5个亚组，分别在制模3天、7天、10天、14天、21天处死，并采用小鼠一般状态标注法、拟临床癌性肠梗阻监测法及病理学方法比较两组差异。结果研究组制模成瘤率100%(25/25)。在小鼠模型一般状态的数据分析中，发现研究组与对照组相比在制模后10天起平均进食量、体重及粪便量明显减少，其差异有统计学意义(P<0.05)。在拟临床癌性肠梗阻监测数据分析中，发现研究组在制模后7天起平均腹围、肠道内压力及梗阻上段肠管周径明显高于对照组，其差异有统计学意义(P<0.05)。在病理学检测数据分析中，发现研究组在制模后7 d起成瘤，制模后14天起肿瘤环腔生长，并逐渐出现梗阻性结肠癌样改变。结论小鼠梗阻性结肠癌模型的建立方法简便、肠管损伤程度小、可行、安全、死亡率低，且制模稳定性高；反映了临床梗阻性结肠癌的病理生理演变过程，为较理想的动物模型。

梗阻性结肠癌；小鼠模型；模型稳定性

梗阻性结肠癌(obstructive colon cancer, OCC)是临床上较常见的外科急腹症，约10%～30%结肠癌病人合并有肠梗阻，其中约80%为老年病人[1]。梗阻性结肠癌患者，不仅在手术时机的选择上，且对是否有必要延长术前准备施行肿瘤切除加I期吻合，是否行根治性手术治疗以及II期结肠癌患者术后是否必须进行系统化疗等问题上均有分歧[2]。梗阻性结肠癌患者不论选择怎样的手术治疗方式，住院时间和恢复时间会较长，也对病人家庭和社会带来不小的经济负担。本研究通过小鼠模型模拟临床梗阻性结肠癌，并采用小鼠一般状态、拟临床肠梗阻监测法及病理学方法比较两组差异，验证该动物模型在操作技术上的可行性及制模过程中的稳定性。

1 材料和方法

1.1 材 料

BALb/c小鼠50只，16～18 g体重，6周龄雌性，于大连医科大学实验动物研究中心购买；小鼠CT26结肠癌细胞株由大连大学附属新华医院中心实验室传代捐助；小牛血清、RPMI1640培养基、胰酶消化液及PBS由大连大学附属新华医院中心实验室提供。

1.2 方 法

1.2.1 肿瘤细胞培养及混悬液制备：小鼠CT26结肠癌细胞株在5% CO2、37 ℃培养箱环境下，并在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中传代培养，且2～3 d/次更换培养基。培养癌细胞达80%～90%融合时，用0.25%胰酶消化液溶解后，1200 r/min离心3 min，弃上清液，加入PBS清洗癌细胞2次，显微镜下计数，并制备成5×107/mL。将制备好的癌细胞混悬液放入冰浴保存，于30 min内进行癌细胞接种。

1.2.2 动物模型设计：建立模型1周前BALb/c小鼠不进行任何刺激。将50只BALb/c小鼠随机分成25只梗阻性结肠癌模型组(研究组)和25只PBS替代癌细胞模型组(对照组)，制模后两组小鼠再分成5个亚组，分别在制模后3天、7天、10天、14天、21天处死，并观察两组的相关指标。

1.2.3 体视显微镜辅助下建立的梗阻性结肠癌模型：制模前给予禁食1 h，但不禁水。依照麻醉预实验结果选用七氟醚加简易呼吸机进行全身麻醉。常规术区剃毛、消毒皮肤，取脐上正中切口，长约1.0 cm入腹选定似降结肠处为结肠癌种植部位，采用人小肠营养管并用PBS进行经肛清洁灌肠。将一小动物专用肠钳夹闭所定种植部位的近端，待注入5×106/100 μL小鼠CT26结肠癌细胞的鼻饲器经肛置入至肠钳夹闭处，注入癌细胞后退出鼻饲管，同时立即距近端肠钳1.0 cm处夹闭另一肠钳，待3 min后撤除肠钳。将似降结肠轻柔送回腹腔后，关闭两层腹壁。所有操作过程均在体视显微镜(Olympus SZ61TR型；北京)辅助下完成。在制模过程中，肠管应注意轻柔钳夹，不能人为导致机械性肠梗阻。

1.2.4 梗阻性结肠癌制模成效标准：(1)成瘤有效；(2)癌性肠梗阻征象；(3)带瘤存活。肿瘤大小、范围及环腔生长程度等不作为必备项目。

1.2.5 观察相关指标：小鼠一般状态标注法：(1)一般情况：观察小鼠毛光泽度、步态及活动量，2次/d；(2)小鼠进食量：测量小鼠平均进食量，1次/d，也包括平均进水量；(3)小鼠体重：测量每只小鼠体重，1次/d；(4)粪便量：观察粪便性状，收集每笼小鼠粪便，并测量平均粪便排出量，1次/d。拟临床癌性肠梗阻监测法：(1)腹围测量：分别在制模当日(0天)或制模后3天、7天、10天、14天、21天，在全身麻醉下测量小鼠腹围(单位:mm)；(2)梗阻或制模上段肠管周径：分别在制模当日(0天)或制模后3天、7天、10天、14天、21天，在全身麻醉下开腹显露扩张的结肠，采用纸尺测量梗阻或制模上段扩张肠管的最大和最小周径；测量公式如下，梗阻或制模上段肠管周径=(最大周径+最小周径)/2 (单位:mm)；(3)肠道内压力测定：分别在制模当日(0天)或制模后3天、7天、10天、14天、21天，在全身麻醉下开腹显露回肠末端并用肠钳夹闭回肠末端，经肛插入鼻饲器约3 cm左右连接吊挂生理盐水的输液器，观察生理盐水液面，停止高度为肠道内压力，单位为mmH2O。病理学方法：(1)标本大体观：肉眼观察梗阻上段、梗阻段及梗阻下段肠管的扩张、颜色、水肿及破溃程度，完整切取包括回肠末端的结直肠，纵行剖开肠管后冲洗干净，判断梗阻部位，测量肿瘤大小、范围及环腔生长程度；(2)标本显微镜下观：所有标本以制模降结肠段为中心切取，用4% PFA浸泡固定，石蜡包埋并切片，进行HE染色，显微镜下观察肿瘤浸润深度等情况。所有可疑病变或存留证据均性拍照。

1.3 统计学方法

选用SPSS 14.0统计软件包进行统计处理。所有实验数据以Mean±SD表示，两组间相互比较用t-test，P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠模型一般状态和拟临床癌性肠梗阻监测分析

研究组制模成瘤率达100%(25/25)。在小鼠模型一般状态的数据分析中，发现研究组小鼠毛粗糙、步态迟缓及活动量少，并制模后10天起与对照组相比平均进食量、体重及粪便量明显减少，其差异有统计学意义(分别为P=0.001,P<0.001及P=0.019)，见图1。在拟临床癌性肠梗阻监测数据分析中，发现研究组制模后7天起平均腹围、肠道内压力、梗阻或制模上段肠管周径明显高于对照组，其差异有统计学意义(均为P<0.05)，详见表1。

A：两组进食量数据比较；B：两组体重数据比较；C：两组粪便量数据比较图1 两组连续不同时段一般状态的数据比较Fig 1 General conditions of data of two groups in consecutive days

Tab 1 Obdominal circumference, intestinal pressure, and circumference of the intestinal which located at upper the obstruction site of two groups at different days

腹围(mm)梗阻或制模上段肠管周径(mm)肠道内压力(mmH2O)研究组制模当日(0d)93.50±3.709.38±0.4842.50±2.083d94.00±3.7410.75±0.6553.25±2.507d104.00±5.941)2)3)4)12.75±0.655)6)7)8)65.25±2.999)10)11)12)10d120.50±4.801)2)3)4)14.00±0.415)6)7)8)83.25±5.389)10)11)12)14d151.75±12.711)2)3)4)16.63±1.115)6)7)8)118.00±5.729)10)11)12)21d271.00±14.311)2)3)4)21.25±1.045)6)7)8)149.25±5.859)10)11)12)对照组制模当日(0d)93.00±4.409.50±0.4142.50±2.383d93.25±3.3010.88±0.6354.00±2.947d94.00±2.319.50±0.4143.25±1.7110d95.50±3.119.63±0.2543.50±1.2914d97.00±3.749.50±0.4143.75±1.7121d101.25±4.039.75±0.6545.75±1.89

1)5)9)与研究组0天相比，均为P<0.05；2)6)10)与研究组3天相比，均为P<0.05；3)7)11)与对照组0天相比，P<0.05；4)8)12)与相对应的对照组相比，均为P<0.05

2.2 小鼠模型病理学检测分析

在病理学检测数据分析中，发现研究组在制模7天后起成瘤，制模14天后起肿瘤环腔生长，并逐渐出现梗阻性结肠癌改变，见图2。提示制模后14天是小鼠模型成败的关键节点，也是监测制模稳定性或安全性的起始点。

A：制模后3天腹部情况，无肠管扩张；B：制模后7 d腹部情况，肠管开始扩张；C：制模后10天腹部情况，结肠扩张明显；D：制模后14天腹部情况，开始出现肠梗阻样改变；E：制模后21天腹部情况，结肠高度扩张，频临死亡；F：体视显微镜下观察的制模14天后起梗阻端肠管的大体观；G：体视显微镜下观察的制模14天后起环腔生长的结肠肿瘤大体观；H：显微镜下可见浸润至黏膜下层、肌层的梗阻性结肠癌模型标本，放大倍数为200倍，标尺为100 μm。图2 梗阻性结肠癌模型制作的围手术及病理学检测结果Fig 2 Prioperation and pathological ressults in obstructive colon cancer BALb/c mouse model

3 讨 论

梗阻性结肠癌是肿瘤晚期表现，且由于结肠入口的回盲瓣解剖的影响，相当大小的结肠癌往往出现闭襻性低位梗阻。梗阻性结肠癌与非梗阻性结肠癌相比，其治疗原则为肿瘤切除为主导，并有效延长生存时间及改善生存质量[3]。临床研究证实，持续高质量改进术前、术中肠梗阻灌洗后，梗阻性结肠癌实施择期手术治疗的疗效明显优于急诊手术，且择期施行I期吻合术后吻合口瘘等安全性风险评估也明显低于急诊手术[4]。但目前针对梗阻性结肠癌的基础研究较少。

对于炎性肠梗阻的动物模型制作，主要采用棉签擦拭肠管法，此操作法为非机械性肠梗阻模型制作方法[5-6]。通过术后胃肠道推进功能试验、肠管MDA含量、肠管SOD活性检测以及Real-time PCR检测IL-6、IL-1β、TNF-α、ICAM-1、MCP-1、MIP-1α来评估不同手术创伤对大鼠术后炎性肠梗阻的影响。对于不完全性肠梗阻的动物模型制作，主要采用套环法，此操作法为机械性肠梗阻模型制作方法[7-8]。通过Lefort式评分标准、梗阻上段肠管平均周径以及Haglund和Osterberg损伤评分来评估套环法与丝线法相比的优势，为进一步研究早期临床不完全肠梗阻提供良好的动物模型平台。

从基础研究着手，本研究模拟了临床梗阻性结肠癌动物模型，也符合本研究设计的初衷。其小鼠梗阻性结肠癌模型的优越性在于：(1)操作简便，易模仿；(2)非机械性肠梗阻或炎性肠梗阻模型；(3)模型成功率极高；(4)制模稳定性高；(5)符合结肠癌浸润生长方式；(6)制模选择了常见的左半结肠。是为较理想的梗阻性结肠癌模型。本研究将肿瘤种植部位选取在操作相对方便的距肛门较近的似降结肠解剖位置，并在5×106CT26结肠癌细胞株条件下制模速效，且肿瘤生长方式为浸润性环腔生长，但模型所致梗阻与肿瘤大小和狭窄程度并无直接相关(P>0.05)。由于本研究选取了单一小鼠结肠癌细胞株，而数据统计上相对偏面。因此，非常有必要在多种人结肠癌细胞株选项的裸鼠梗阻性结肠癌模型中进一步证实。

综上所述，小鼠梗阻性结肠癌模型的建立方法简便、肠道损伤程度小、可行、安全、死亡率低，且制模稳定性高；本研究反映了临床梗阻性结肠癌的病理生理演变过程，为较理想的动物模型；为深入了解梗阻性结肠癌的发病机理或寻求更加有效的诊治手段提供优质的动物模型平台。

[2] Park SJ, Lee KY, Kwon SH, et al. Stenting as a Bridge to Surgery for Obstructive Colon Cancer: Does It Have Surgical Merit or Oncologic Demerit?[J]. Ann Surg Oncol, 2016, 23(3):842-848.

[3] Lee WS, Baek JH, Kang JM,et al. The outcome after stent placement or surgery as the initial treatment for obstructive primary tumor in patients with stage IV colon cancer[J]. Am J Surg, 2012, 203(6):715-719.

[4] Zhang Y, Shi J, Shi B, et al. Self-expanding metallic stent as a bridge to surgery versus emergency surgery for obstructive colorectal cancer: a meta-analysis[J]. Surg Endosc, 2012, 26(1):110-119.

[5] 余震, 陈伟哲, 庄成乐, 等. 术后肠梗阻动物模型的建立[J]. 中华实验外科杂志, 2014, 31(4): 914.

[6] Fraser GL, Venkova K, Hoveyda HR, et al. Effect of the ghrelin receptor agonist TZP-101 on colonic transit in a rat model of postoperative ileus[J]. Eur J Pharmacol, 2009, 604(1-3):132-137.

[7] 李禹呈, 杨拯, 袁梦郎, 等. 新方法建立大鼠不完全性肠梗阻模型的实验研究[J]. 四川动物, 2013, 32(2):276-279.

[8] El-Awady SI, El-Nagar M, El-Dakar M, et al. Bacterial translocation in an experimental intestinal obstruction model. C-reactive protein reliability?[J].Acta Cir Bras, 2009, 24(2):98-106.

EstablishmentandstabilityanalysisofostructivecoloncancermodelinexperimentalBALb/cmice

ZHAO Xuefeng, WANG Yi, XU Guangda

(DepartmentofGeneralSurgery,DalianUniversityAffiliatedXinhuaHospital,Dalian116021,China)

ObjectiveTo establish of obstructive colon cancer model in BALb/c mice with method and verify its stability.MethodsThe 50 BALb/c mice were randomized into two groups, 25 obstructive colon cancer model group (study group) and 25 PBS replaces cancer cells model group (control group). After the model, the mice were divided into five sub-groups, and executed in postoperative 3, 7, 10, 14 and 21 day respectively. BALb/c mice of general conditions, simulative cancerous intestinal obstruction of surveilance method, and histopathological examination were evaluated in two groups.ResultsThe rates of tumor formation was 100.0% (25/25) in the study group. BALb/c mice model of general conditions of data analysis, study group had a significantly losses mean food intake, weight, and excrement in the postoperative 10 days (P<0.05). The simulative cancerous intestinal obstruction of surveilance method of data analysis, study group showed significantly mean increase obdominal circumference, intestinal pressure, and circumference of the intestinal which located at upper the obstruction site in the postoperative 7 days (P<0.05). The histopathological examination of data analysis, tumor formation time was postoperative 7 days, and colon circumferential growth and obstructive colon cancer of times were postoperative 14 days.ConclusionThe modified method to establish a BALb/c mice of obstructive colon cancer model are operational simple, reduces intestinal injury, technically feasible, oncological safety, loss mortality, and higher stability. That has basically reflected pathological physiological evolution of clinical obstructive colon cancer, and are desired animal models.

obstructive colon cancer; BALb/c mice model; model stability

辽宁省自然科学基金项目(201602037)；大连大学博士启动基金项目(20151QL019)

赵雪峰(1974-)，男，副教授。E-mail:zhaoxuefeng74@hanmail.net

许广大，教授。E-mail:XuGuangDa1688@163.com

10.11724/jdmu.2017.06.15

R735.3+5

A

1671-7295(2017)06-0584-05

赵雪峰，王艺，许广大.小鼠梗阻性结肠癌模型的建立与稳定性分析[J].大连医科大学学报，2017,39(6)：584-588.

2017-06-26；

2017-11-28)