徐小文 王义勋 刘星

摘要：概述了近年来国内外学者在松材线虫病致病机理研究方面的进展。该病害的致病决定因子主要包括几个理化特性，①由线虫食道腺产生的细胞壁水解酶，通过作用寄主细胞壁来帮助线虫侵入、扩散，最终影响寄主水分传输；②松材线虫分泌的部分蛋白会参与到与寄主细胞的互作中来；③松材线虫本身产生的植物毒素和其携带的细菌分泌的毒素可使寄主松树萎蔫；④松材线虫表面蛋白的作用。

关键词：松材线虫病；致病机理；综述

中图分类号：S432.4；S791.24 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）20-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.20.001 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： This article provided a comprehensive overview of recent advances in the pathogenesis of pine wilt disease by scholars at home and abroad. Several physical and chemical traits have been studied as pathogenicity determinants. First， cell wall-degrading enzymes excreted of pine wood nematode（PWN） are used to help nematode migration by degrading the cell wall of host and thereby broken the water transportation； Second， some excreted proteins by PWN could be involved in nematode-plant interactions； Third， phytotoxins secreted by bacteria that are carried by PWN and toxins produced by PWN are proposed to arouse pine wilt； Fourth， surface coat proteins of PWN play important roles in the pathogenicity of it.

Key words： pine wilt disease； pathogenetic mechanism； review

松材线虫病是由滑刃科（Aphelenchoididae）伞滑刃属（Bursaphelenchus）的松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起的松树上的一种毁灭性病害。该病害可使高感植株在感染后较短时间内（2～3个月）萎蔫死亡，所以又被称为松树萎蔫病[1]。经研究统计，已有高达50多种松属树种和10多种非松属树种成为该病害的为害对象[2，3]。自1905年在日本长崎大暴发以来，该病害不断在世界各地被发现，截至目前该病已在亚洲、欧洲和北美洲等地的多个国家被发现和报道[4，5]。而在中国，据国家林业局2018年发布的公告显示，中国松材线虫病的疫区已扩散蔓延至16个省（自治区）。因此，松材线虫病严重威胁林业生态环境的安全，值得学者对其进行长期深入的研究，以期早日攻克该病害。

1 松材线虫病的致病机理

基于松材线虫病的重要性和复杂性，对该病致病机理的研究长期以來是热点。综合近年来的研究结果，对该病害的致病机理研究综述如下。

1.1 细胞壁降解酶的作用

松材线虫病的早期病症离不开线虫产生的一系列水解酶的作用，这些酶类被认为是决定线虫致病性的关键因子，比如纤维素酶、果胶酶等[6]。这些酶类能够通过降解和破坏寄主植株的细胞壁或细胞膜来帮助线虫侵染。当寄主的细胞壁和细胞膜被水解酶有效破坏后，树脂道中的树脂会因此发生渗漏，最后造成的结果是树脂扩散到了相邻的管胞中，从而影响水分的正常传输，诱发寄主萎蔫[2]。Odani等[7]通过体外试验证明用松材线虫分泌的含纤维素酶的粗提物和商品化的纤维素酶、果胶酶等水解酶类处理赤松的幼苗都有与松材线虫侵染相同的症状，由此说明这些水解酶类参与松材线虫病的病理反应。而编码这些酶类基因的来源是什么呢？Kikuchi等[8]2004年利用分子生物学手段研究了来自松材线虫的一个编码糖基水解酶的基因家族第45纤维素酶类，结果表明这些酶基因以基因转移的方式从真菌中获得；而该研究小组又在2005年发表文章揭示松材线虫中编码内切β-1，3-葡聚糖酶的基因来自细菌的基因水平转移[9]。正是不同物种间水解酶基因的水平转移使得松材线虫获得了更好的适应能力[8，9]。尽管这些细胞壁水解酶类在线虫与植株的互作中起到重要的作用，但是由于在不具致病性的拟松材线虫中也存在这些水解酶类，而且目前缺乏此类酶参与致病的直接证据，所以该类酶的确切功能仍需探讨。Ma等[10]通过RNAi技术证明纤维素酶被干扰表达后导致松材线虫的繁殖力和扩散能力显著下降。因此，一个可能的解释是这些由线虫食道腺细胞产生的酶类主要作用于线虫在寄主植物内的移动[11]。

1.2 参与线虫与寄主互作过程的寄生蛋白的作用

尽管对于线虫与寄主互作过程中参与的寄生蛋白的研究已有不少，但研究对象多集中在寄主内部不发生移动的固定线虫，比如主要危害植物根部的根结线虫和胞囊线虫。通过对这两种线虫食道腺细胞的转录组学分析，鉴定出了大量的与寄生相关的基因，它们能编码不同的效应蛋白来协助线虫寄生[12-16]。对松材线虫寄生基因或者效应因子的研究近年来取得了较大进展。Shinya等[17]在2013年通过高灵敏度的蛋白质组学结合可靠的基因组序列信息，分析鉴定出了1 515个松材线虫的分泌蛋白，它们的功能主要为营养物质的摄取、寄主内的迁移扩散和躲避寄主防御系统等。进一步分析松材线虫分泌蛋白组学中鉴定出的肽段后发现，与对照相比，这些显著增加的分泌蛋白和蛋白抑制子来源于基因倍增和不同物种间的基因水平转移。Espada等[18]在2016年通过分析比较松材线虫幼虫期和成虫期的转录组学数据及借助效应蛋白预测工具鉴定出了许多新的寄生相关基因，这些基因被认为很可能介导松材线虫与寄主的互作，而后在采用原位杂交技术深入研究这些寄生基因后表明它们总体可以被归纳为两类解毒蛋白，一类在食道腺细胞特异表达，另一类在消化系统特异表达，这些解毒蛋白能够帮助线虫成功侵染寄主。

1.3 植物毒素和细菌毒素的作用

当松树被松材线虫侵染后，病程的发展十分迅速，而且寄主发生细胞死亡的时间比线虫大量繁殖的时间要早，表明线虫可能通过产生植物毒素来诱导寄主的细胞死亡。Oku等[19]自1979年开始尝试在受害松树中提取毒素候选物，并不断开展试验验证，发现将病树的粗提物接种到健康的松树苗上会使其萎蔫，而健康松树的粗提物则不会。另外，不同品种的松树对相同粗提物的耐受度也不一样，感病株比抗病株对粗提物更敏感。分析粗提物的化学组分，然后单独使用鉴定出的化学物接种后发现，苯甲酸、8-羟基香芹酮和二羟松柏醇是使松苗萎蔫的原因。Shaheen等[20]在1984年采用两种不同的方法从不同品种的病松树中提取化合物来接种松树苗，结果表明无论是用炭抽提法还是基于三氯甲烷的抽提法得到的物质都能使健康的两年生的松树苗在一周至一个月内出现萎蔫，抽提化合物造成松苗萎蔫的效率与其剂量呈正相关。将抽提物中的化学组分进行分析鉴定和接种试验后证明，其中的香芹酮水合物和10-羟基马鞭烯酮都具备使松苗发生萎蔫的功能[1，20]。虽然学者们通过试验观察到这些粗提物导致植株萎蔫的现象伴随着植物气孔的大量关闭，从而推测它们参与寄主的蒸腾作用，但具体这些代谢物的来源和功能仍需更深入的研究[20，21]。

线虫携带的细菌也是毒素的来源。松材线虫携带的细菌数量多、种类杂，有研究表明一头成年线虫的体表有多达290个细菌[22-24]。假单胞菌属、黄单胞菌属、泛菌属、链球菌属、肠杆菌属、布丘氏菌属、葡萄球菌属等都包含其中[25-29]。各国学者通过分析不同国家和地区松材线虫病疫区里的线虫所携带的细菌后对于这些细菌的来源有两个假说，一是它们被线虫携带后用来促进病害的发生，这些细菌要么只能够通过线虫进入寄主松树，要么本身就存在于松树体内，而松材线虫侵入后，二者之间形成了共生关系；二是这些细菌附着在线虫的体表，它们与病树的萎蔫症状无关。这些不同来源的细菌的功能是什么呢？Oku等[25]研究发现松材线虫体表携带假单胞菌，而该细菌能够分泌使得松树萎蔫的毒素。Kawazu等[30，31]发现松材线虫携带的3种细菌能够产生苯甲酸，而苯甲酸是造成松树萎蔫的原因。该研究小组认为死亡的线虫可以作为这些产生苯甲酸毒素的细菌的营养来源。与强致病力的松材线虫相比，低致病力的松材线虫携带细菌产生苯甲酸的量显著降低，表明线虫体表细菌产生苯甲酸的能力决定了线虫的致病力。Han等[32]在2003年经试验证明，将无菌的线虫接种松苗不能使其发生萎蔫，但是将假单胞菌和线虫混合后接种却能够引起松苗萎蔫，由此认为松材线虫病的病因是线虫和其携带细菌共同作用的结果。Zhao等[33]在2011年发现将无菌松材线虫与7个分离到的芽孢杆菌属或者寡养单胞菌属中的任何一个组合接种松苗都能导致松苗萎蔫。Zhao等[28]在病树上的线虫体表分离到24个细菌菌株，其中有17个被证明能够产生植物毒素。Guo等[23]研究发现线虫携带的部分细菌能够分泌鞭毛蛋白和环二肽等对松苗有毒的蛋白。近年来，也有研究表明线虫携带的细菌所属的种类对碳元素的利用率越高，线虫的致病力就越强，说明线虫携带细菌的碳代谢水平与其致病力密切相关[34]。关于线虫携带细菌的研究报道有很多，但是目前仍然有很多疑问和难点需要进一步的研究，比如这些细菌与线虫的寄主范围之间的关系，线虫致病力有无与其的关系等。

1.4 表面外壳蛋白的作用

线虫的体表还携带有许多蛋白，这些蛋白也可能是决定线虫致病力的因子。它们能够与寄主细胞直接互作从而影响病情的发展。凝集素结合试验表明松材线虫毒力株和无毒株卵壳表面的碳水化合物的组分不一样[35]。Shinya等[36]通过凝集素结合试验来分析不同发育阶段的松材线虫的表面外壳蛋白，结果表明糖蛋白在不同的发育阶段有明显的变化。蛋白组学手段也被用来分析松材线虫表面外壳蛋白的种类，结果表明从松苗上提取的线虫的表面外壳蛋白的数量是在实验室内用线虫食用真菌培养的松材线虫的9倍，其中有37种蛋白在二者之间有显著的表达量差异。这37种蛋白被进行了深入解析，在被鉴定出来的32种蛋白中，有17种蛋白的表达量在松苗被感染后显著上调，6种蛋白表达量显著下调，另外9种蛋白来自细菌[36]。这些上调表达蛋白的功能经生物信息学分析后发现可能参与响应寄主的防御反应。上述研究表明，松材线虫体表的外壳蛋白的数量和种类会随着线虫的发育和活动而发生变化，其中更有参与响应寄主防卫反应的蛋白，由此可以推断，表面外壳蛋白在线虫与环境，尤其是寄主间互作中起重要的调控作用[37]。Davies等[38]总结得出，以模式生物秀丽隐杆线虫为研究对象，发现线虫可以通过感应植物的信号从而改变表面外壳蛋白的组分和结构来适应新的寄主环境或者逃避寄主的防御反应，在松材线虫中这些表面外壳蛋白的组分也随着线虫发育阶段不同或者其致病力的不同而有差异，可以推测这些蛋白参与了寄主信号响应，在松材线虫的致病力和寄主环境适应性上起到了重要作用。

2 结语

松材线虫病自发现以来，许多科研团队都投入了大量的精力来研究该病害的发病规律和试图提出防治策略，但由于此病害涉及的影响因素很多，包括线虫本身、真菌、细菌、松树、传播媒介昆虫以及温度、湿度等环境因子，导致了目前对松材线虫病的致病机理及防治手段都没有解析完全和根本解决[1]。作者列举了近年来在松材线虫致病机理方面的研究成果，但概括而言，仍然有许多问题值得深入研究，比如松材线虫分泌蛋白的靶标蛋白和具体功能、松材线虫分泌的植物毒素有效物质和作用方式、寄主的内生菌影响、线虫与传播媒介的互作等。随着科学技术的发展和科研水平的日益提高，不斷地有新技术应用到该病害研究上来，比如蛋白质组学、代谢组学等，相信不久的将来，对松材线虫病的研究会取得更大进展。

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