刘庆庆 刘巍

摘 要： 笔者针对中国药典2015 年版非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的主要增修订情况进行了相关解读。

关键词： 微生物限度检查；计数法

0 引言

2014 年3月28日，国家药典委员会发布了《中国药典》2015年版通则征求意见稿（通则公示稿），与《中国药典》2010 年版比较，2015年版在微生物限度检查方法和指导原则上均做了较大的修订。修订的内容主要包括了非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（ 通则1105）、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）及非无菌药品微生物限度标准（通则1107）等，修订后的微生物限度检查方法与《美国药典》基本一致。这对于需要进口或出口的药品生产企业来说，因检测方法基本一致，检测结果将具有可比性，并减少了资源浪费。

1 药品微生物限度检查法的变迁

1995 年版《中国药典》第一次提出药品微生物限度检查法，2005 年版《中国药典》第一次提出要对所有用于检查药品微生物的方法进行方法学验证，以防因检验方法不科学造成漏检或误判；2010 年版《中国药典》中则又一次强调了进行微生物检验方法学验证的重要性，强调方法确认过程；2015年版《中国药典》将方法学验证修订为方法适用性试验，更加重视对于检验全过程的控制，达到试验条件、检验方法和判定标准三者的统一，使检验结果更具可比性，真正做到与国际标准接轨。

2 药品微生物计数方法的建立和确认

2.1 检验方法的选择

药品微生物计数方法通常包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（简称MPN 法）。平皿法应用较广，是最常用的微生物计数方法，也是方法适用性试验的首选；薄膜过滤法适用于有较强抑菌作用且具较强溶液性的供试品；最可能数法因其精确度较差，更适合于某些受微生物污染程度较小的供试品。在选择计数方法时，首先应根据供试品的理化特性和微生物限度标准，选择操作简便、快速的方法；其次应考虑供试品的抑菌性，在使用中和剂或消除抑菌作用时应避免损伤供试品中污染的微生物。选择方法后应对所选方法的适用性进行确认。

2.2 检验方法的建立

一般来说，多数中成药制剂都需要进行需氧菌总数计数，通常应依据药品自身的特点和标准限值，来拟定检验方法，并对计数方法进行适用性试验，并确认其结果的有效性。例如，实验室采用不同的方法测定某中成药口服液的需氧菌总数，由于中药制剂受微生物污染的可能性较大，故先拟定平皿法和薄膜过滤法为检验方法，并对此方法进行适用性试验。

2.2.1 供试液的制备

取供试品10g，加入pH7.0 的无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液至100 mL，充分振摇使其溶解，制成1∶10 比例的均匀供试液备用。

2.2.2 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌以及枯草芽孢杆菌的新鲜培养物到胰酪大豆胨液体培养基中，在35℃的温度下培养18～24 h，并将此培养物用0.9% 无菌氯化钠溶液稀释至菌落数约为104 cfu/mL 的菌悬液。

2.2.3 试验方法

（1）平皿法试验组：取上述供试液9.9 mL，加入上述菌悬液0.1 mL，使之充分混合均匀，吸取1 mL 混合液至无菌平皿中，然后倾注胰酪胨大豆琼脂培养基，混合均匀，凝固，需平行制备2个平皿，在35℃温度下培养3 d。

（2）薄膜过滤法试验组：试验前应先将少量的pH7.0的无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液滤过，以润湿滤膜，然后取上述供试液1mL，加入100 mL上述稀释液，充分混匀，全量滤过后以此稀释液冲洗滤膜，每次冲洗100mL，冲洗3次，总冲洗量为300mL，在第3次冲洗液中加入不高于100cfu的试验菌液，混合均匀后抽滤，然后转移滤膜，使其菌面朝上贴在胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，在35℃的条件下培养3d。

供试品对照组：取以上供试液，用稀释液代替菌液同试验组进行操作。菌液对照组：用稀释液代替供试液，按试验组方法加入试验菌液。

3 计数法适用范围的变化

3.1 嗜温细菌和真菌的计数

修订后的微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。与医药相关的细菌大多数是嗜温的，其生长温度为20～40℃，真菌是一类重要的致病源，人类最常见的真菌病原体可以分为酵母、霉菌和皮肤真菌。尽管嗜温细菌、真菌是影响药物安全性最主要的因素，其他与特定药品相关微生物也需要关注其有害性。新版药典以微生物的生理特点和生长特性为依据，科学地将细菌数修订为需氧菌总数（定义为生长在胰酪大豆胨琼脂培養基上所有菌落，也包括霉菌和酵母菌），霉菌和酵母菌数修订为霉菌和酵母菌总数（一般指生长在沙氏葡萄糖琼脂上的所有菌落，也包括细菌菌落数）。如果由于细菌的生长而使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含有抗生素的沙氏葡萄糖琼脂培养基重新进行计数。

3.2 新版药典计数法不适用于活菌制剂的检查

微生态活菌制品是由非致病的活菌组成，本身即是微生物，因此新版药典第三部各论项下的微生态活菌制品总论对其检测有专门规定。修订后的非无菌产品微生物计数法明确了其不适用于活菌制剂的检查，增加了中国药典2010年版一、二部未规定的事项，方法的应用范围更加明晰、严谨。

3.3 明确了可采用替代法

可采用自动检测等方法替代药典方法，但须证明替代方法等效于药典规定的方法。这一原则使得方法更具科学性、时代性、开放性和灵活性，有利于鼓励方法创新和现代仪器设备的使用，促进检测技术的发展。

3.4 增加了检测产品范围

新版药典规定微生物计数法适用于生物制品和医疗器械等其他产品，强调了除药品外的其他医药产品也可应用。

4 计数法检测环境的变化

中国药典2010年版规定微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100 级单向流空气区域内进行。而2010 年版《药品生产质量管理规范》，引入了动态连续监测，将药品生产所需的洁净区分为A、B、C、D 4 个级别。各国药典对检验检测环境通常只做出了在适宜的洁净度的环境中进行的要求。基于我国国情，新版药典对检验检测环境仅做原则性要求，试验环境必须符合微生物限度检查的要求。但在通则9203 药品微生物实验室质量管理指导原则中给出具体指导意见，微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进行。对出具法定药品检验报告书的实验室，检验环境低于生产环境将会导致报告书的权威性受到挑战，从长远的观点看，检验环境应不低于生产环境。

5 计数检测用试剂试药的变化

污染微生物在供试品中的分布具有随机性、不均匀性的特点，供试液制备过程中，中和剂、灭活剂和表面活性剂应对微生物生长无毒，相互间具有相容性，有利于供试品中微生物均匀分布，提高计数的准确性以真实反映药物的微生物污染状况。中国药典2015年版新增了“供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性及所使用中和剂或灭活剂的相容性”的要求。相容性要求供试品不一定要完全溶解于稀释液中，但要均匀分散，形成均一、稳定的供试液分散体系，这是获得高准确性和良好检验结果的基础。

结语

新版药典微生物检查体系在样品前处理、微生物选择性培养和鉴定确认等方面的规定更为灵活，为检验技术的创新发展提供了空间，有利于药品质量从最终产品检验向过程控制转变。通过增修订，新版药典药品微生物控制标准体系不仅实现了中国药典三部通则的统一，且解决了中国药典与ICH 协调案的协调问题，完全实现了与国际标准的接轨，必将为推动我国药品标准及药品的国际交流与贸易做出积极贡献。

参考文献

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：2015 年版四部. 北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 胡昌勤. 药品微生物控制现状与展望. 中国药学杂志，2015，50（20）：1747-1751.