周 鹏，张 敏

（江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153）

盐胁迫对灌木柳体内离子分布的影响

周 鹏，张 敏

（江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153）

以2个耐盐性不同的灌木柳为材料，采用营养液水培，用100 mmol·L-1NaCl处理幼苗10 d，研究盐胁迫下离子在器官、组织和细胞水平上区域化分布的特性。结果表明：（1）NaCl胁迫下，灌木柳植株体内K+含量下降，Na+和Cl-含量升高；不同器官间，茎中Na+和Cl-含量最高，叶中Na+和Cl-含量最低；根向茎运输SK,Na值降低，茎向叶运输SK,Na值提高。（2）与耐盐性较弱的JW2367相比，耐盐性较强的JW2345SK,Na值变化幅度较大，茎对Na+的截留作用较强，而叶片中Na+积累较少，且K+含量下降幅度较小，说明离子区域化分布的调控能力相对较强，是JW2345耐盐性较强的主要原因之一。（3）对耐盐型JW2345根、茎和叶片横切面进行X射线微区分析表明，盐胁迫下Na+、K+和Cl-在根各组织间均呈均匀分布；在茎中，与对照相比，髓部Na+、Cl-升高幅度明显高于周皮和微管组织；叶片栅栏组织中Na+、Cl-相对含量增幅最小，且K+相对含量明显高于表皮和海绵组织。（4）盐胁迫下JW2345茎髓部细胞内离子分布结果显示，液泡对Na+和Cl-具有明显的区隔化作用，表明柳树茎髓细胞水平上离子区隔化分布是避免细胞受盐分毒害的重要机制。

盐胁迫；灌木柳；离子分布；选择性运输

土壤盐渍化是世界性的资源和生态问题，已成为全球变化研究框架下的重要内容。各类盐土资源，特别是沿海滩涂，作为一种重要的土地后备资源，亟待合理开发和综合利用。选育耐盐林木优良品种，提高林木耐盐性，发展生态林业，对加强沿海滩涂的治理和综合开发利用具有重要意义[1-2]。柳树SalixL.种质资源丰富，为耐盐遗传改良提供了丰富的遗传基础。其中，灌木类柳林轮伐期短，郁闭快，管理粗放，被认为是选育速生、耐盐树种的理想材料[3]。江苏省林业科学研究院近年来系统开展了耐盐碱柳树品种选育工作，对千余份柳树种质资源进行了耐盐性鉴定，并利用筛选的优异种质进行种间杂交，获得了一批优异的耐盐灌木柳新种质，表现出较强的耐盐性[4-6]，但这些新型耐盐种质的耐盐机理尚缺乏研究。

盐胁迫主要造成植物渗透胁迫、离子毒害和矿质营养缺乏。其中，Na+和Cl-对植物危害较重，极易造成植物单盐毒害，同时对K+等的吸收产生拮抗作用，使植物发生营养亏缺，并破坏渗透平衡[7-8]。学者对大豆[9]、棉花[10]、黄瓜[11]、西瓜[7]、甜瓜[12]、白三叶[13]、长春花[14]、芦荟[15]等作物和园艺植物在盐胁迫下体内离子分布情况进行了报道，发现植物耐盐性可能与其调控盐分的选择性吸收及区域化分布的能力密切相关，且不同品种间存在差异。而Na+、K+和Cl-等离子的转运是由质膜和液泡膜上的Na+/H+逆向转运体等蛋白负责，驱动力来自质膜H+-ATPase和液泡膜H+-ATPase及H+-PPase[16]。本课题组前期预研究发现，在NaCl胁迫下，盐耐受型灌木柳液泡膜H+-ATPase的活性和蛋白表达显著增强，推测盐胁迫调节灌木柳液泡膜H+-ATPase活性，可能是与灌木柳在器官、组织和细胞水平上的离子平衡有关。为此，本研究选取2种耐盐性不同的灌木柳无性系为材料，采用营养液水培方法，分别从器官、组织和细胞水平上比较盐胁迫下2种灌木柳无性系离子区域化分布的情况，探讨盐胁迫下柳树体内盐分区域化分布特性与无性系耐盐性的关系，为耐盐树种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为江苏省林业科学院杂交培育的耐盐型JW2345Salix suchowensis×S. integra和盐敏感型JW2367S. viminalis×S. argyracea灌木柳新无性系。

1.2 盐胁迫处理

按张敏等[17]的方法对灌木柳幼苗进行盐胁迫处理，选取株高8 cm、根系发达、生长健壮的组培生根苗移至1/2MS培养液中，适应3 d后，进行NaCl胁迫处理（1/2MS培养液配制盐溶液），并以不添加NaCl作为对照组，每2 d更换一次培养液，以保证盐浓度的一致性。根据前期生物量试验结果[18]，处理组 NaCl浓度选择为 100 mmol·L-1。试验重复3次，每个重复50株，培养10 d后取样测定。

1.3 测定方法

1.3.1 Na+、K+、Cl-的提取和测定

盐胁迫后，植株经去离子水冲洗，分成根、茎和叶3个部分，105℃杀青5 min，于70～80℃下烘干至恒质量。磨碎过筛（30目）后，准确称取样品1.5 g于锥形瓶中，加入5 mL浓HNO3、l mL 30% H2O2，封口放置过夜，利用电热板加热消煮直至无色或清亮后，继续加热赶去HNO3及H2O2，然后加入少量水溶解样品，冷却后将消煮液定容至25 mL。每批样品消煮的同时，进行空白试验，以校正试剂和方法的误差。Na+和K+含量使用ICP-MS（美国Perkin Elmer公司Optima 4300）测定，Cl-含量测定采用AgNO3滴定法[9]。

1.3.2 离子选择性运输系数的测定

器官间离子运输的选择性采用离子运输选择性系数（SK,Na）[13]表示，即源中的Na+、K+向库运输的选择性（源与库SK,Na）= {[K+]库/[Na+]库}/{[K+]源/[Na+]源}。

1.3.3 根、茎和叶横切面X-射线微区分析

参照王景艳等[14]和Zheng等[15]的方法，分别切距根尖1 cm的根横切面，茎中部横切面，同一部位叶片中部横切面，迅速装入铝盒后投入液氮。样品经真空冷冻干燥48 h后，表面经离子溅射仪（日本HITACHI E1010）喷镀黄金，置于环境扫描电镜（美国FEI公司Quanta 200）下观察，并用X-射线能谱显微分析仪（英国Oxford公司INCA X-Act）进行微区元素分析，计算Na+、K+和Cl-含量分别占细胞中无机离子总量的百分率。分别对根、茎和叶横切面各组织进行检测，其中，试验中切取的植株中部茎段横切面为茎的次生结构，选取结构清晰的茎外围的周皮、中心部位的髓和紧靠髓的维管组织进行测定，每一组织区域所测定的微区至少测试5个点。

1.3.4 茎髓细胞中离子分布的测定

样品制备参照了Ebrahimi等[8]的方法，采集中部茎段样品，去皮，取中心髓部位，并用锋利刀片切成1 mm × 1 mm × 2 mm的小块，装入铝制小盒中迅速投入体积比为1∶3的异戊烷和丙烷（液氮冷却），然后进行冷冻干燥，接着转入T型真空渗透管中，在真空25℃下乙醚渗透24 h，再用树脂在常压下渗透24 h，包埋，聚合7 d。利用超薄切片机切片，厚度为1 μm，喷碳后，使用透射电子显微镜（日本EOL Ltd.公司JEM-2100），结合能谱仪（OXFORD Aztec X-Max 80 TEM）分别对细胞壁、细胞质和液泡进行分析。

1.4 数据分析

数据使用Origin 9.0软件绘图，利用SPSS 13.0进行方差方析，并采用Duncan法对数据进行多重比较（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对灌木柳幼苗不同器官中离子含量的影响

表1 显示，100 mmol·L-1NaCl处理幼苗 10 d后，灌木柳两无性系植株根、茎和叶中Na+和Cl-均大幅度增加，其中，茎中Na+和Cl-含量增幅最大，根次之，而叶片最小；Na+和Cl-在各器官的分布情况为茎＞根＞叶，且JW2345茎对Na+和Cl-的贮积量明显高于JW2367（P＜0.05），而叶中Na+和Cl-含量则小于JW2367，有利于减轻对叶片的离子毒害；盐胁迫导致两无性系各器官中K+降低，其中耐盐型JW2345叶片中K+能较好地保持稳态，与对照相比，仅下降11.64%，盐胁迫下JW2345叶片中K+含量显著高于JW2367（P＜0.05），说明JW2345叶片维持K+稳定的能力强于JW2367；K+在各器官的分布为JW2345为叶＞茎＞根，JW2367为茎＞叶＞根。

表1 盐胁迫下植株不同器官中离子含量†Table 1 Contents of icon in different organs in shrub willow under salt stress

2.2 盐胁迫对离子运输选择性的影响

离子运输选择性系数（SK,Na）可反映盐胁迫下植物体对K+和Na+的吸收和运输的选择性，SK,Na值越大，表明对K+吸收或运输的选择性越高，对Na+吸收或运输的选择性越低[19]。图1显示，盐胁迫下灌木柳两无性系根向茎运输的SK,Na值下降，茎向叶运输的SK,Na值均显著上升，表明盐胁迫导致根向茎选择性运输Na+和茎限制Na+向叶运输的能力增强，而茎对K+选择性运输和截留的能力降低。其中，JW2345根向茎运输的SK,Na值处理前后差异达到显著水平（P＜0.05）；与耐盐性较弱的JW2367相比，盐胁迫下，JW2345茎向叶运输的SK,Na值上升幅度较高，SK，Na值是JW2367的2.88倍，表明其茎对Na+的截留作用明显强于JW2367。

图1 盐胁迫对灌木柳K+、Na+运输选择性系数的影响Fig.1 Effect of salt stress on transportation selectivity of K+ to Na+ in shrub willow

2.3 盐胁迫对不同组织中离子分布的影响

为进一步探究柳树体内盐离子在不同组织间的分布特性，对耐盐型无性系JW2345幼苗根、茎和叶横切面进行X射线能谱微区分析，结果（见表2）表明，NaCl处理后，与对照相比，根、茎和叶各组织中Na+和Cl-相对含量均增高，K+相对含量降低。盐胁迫下，根的中柱细胞中Na+相对含量稍高于表皮细胞和皮层细胞，但差异不显著（P＞0.05）；Cl-和K+在根横切面上呈均匀分布，各组织间离子含量无显著差异（P＞0.05）。

与对照相比，茎中周皮、微管组织和髓细胞中Na+和Cl-分别增加8.93倍、4.33倍和14.64倍，髓细胞中Na+和Cl-增幅显著高于周皮和微管组织（P＜0.05）；K+变化规律与Na+和Cl-的变化相反，髓细胞中K+相对含量以及降低幅度明显低于周皮和微管组织（P＜0.05），说明盐胁迫下柳树茎具有显著的离子区域化分布机制。

在叶片中，栅栏组织细胞中Na+和Cl-相对含量增幅明显低于表皮和海绵组织（P＜0.05），说明盐胁迫下，灌木柳幼苗优先将Na+和Cl-积累于表皮和海绵组织细胞中，以减轻对栅栏组织的伤害；叶片各组织细胞中的K+相对含量均有所降低，但栅栏组织细胞中K+含量显著高于表皮细胞和海绵组织（P＜0.05）。

表2 盐胁迫对灌木柳植株不同组织中离子分布的影响Table 2 Effect of salt stress on ionic distribution of different tissues in shrub willow

2.4 盐胁迫对茎髓部细胞内离子分布的影响

由图2可以看出：盐胁迫提高了茎髓细胞各组分中Na+和Cl-的相对含量，且茎髓细胞液泡中Na+和Cl-相对含量显著高于细胞壁和细胞质（P＜0.05），细胞壁中Na+和Cl-高于细胞质，其中Na+相对含量差异达到显著水平（P＜0.05）；与Na+和Cl-变化规律不同，盐胁迫显著降低细胞壁、细胞质和液泡中K+的相对含量，降幅分别为68.94%、26.70%和77.20%，其中细胞质中降幅最小，从而使得细胞质中维持较高水平的K+。

图2 盐胁迫对茎髓部细胞内离子分布的影响Fig.2 Effect of salt stress on icon contents in pith cells of stem in shrub willow

3 结论与讨论

盐胁迫易破坏植物体内的离子平衡，造成离子毒害，导致植株生长受到抑制[20-21]。耐盐植物体内具有显著离子区域化分布特性[22-23]，研究发现，大部分非盐生植物以根为主要的聚Na+部位，利用这些积累在根部的盐离子进行渗透调节，保持吸收水分的能力，以免造成生理干旱，同时减小离子对植株地上部的伤害[24]。本研究中，灌木柳茎为贮存Na+和Cl-的主要器官，这与棉花[10]的研究结果较为一致，可能是由于木本植物茎生物量大，可大量积累离子，另一方面离子在茎中积累可减少对叶和根的伤害。与盐敏感型无性系JW2367相比，耐盐型无性系JW2345茎中Na+和Cl-含量高于JW2367，而根和叶中Na+和Cl-含量较低，且K+含量下降的幅度较小。植株体内离子在器官间的区域化分布与离子运输的选择性密切相关。本试验中，盐胁迫下柳树根向茎运输SK，Na值降低，茎向叶运输SK,Na值提高，使得茎作为Na库收纳植株中的Na+，并作为K源向根和叶提供K+。同时，耐盐无性系JW2345根系向茎运输的SK,Na值和茎向叶片运输的SK,Na值变化幅度均大于JW2367，由此可推测，盐胁迫下离子区域化分布的调控能力相对较强是JW2345耐盐性较强的主要原因之一。

有研究发现，盐胁迫下植物体内离子在不同的组织细胞中分布特征不同[14-15]。本研究中，盐胁迫下，灌木柳根中离子在组织水平上区域化分布不明显，而Na+和Cl-在茎中被优先积累于髓部细胞，使得微管组织和周皮中Na+和Cl-相对含量维持在较低水平，从而减少盐分通过木质部向叶片运输，缓解盐分对植物造成的伤害，说明灌木柳在组织水平上的耐盐机制与器官水平具有一致性。另外，在叶片中，Na+和Cl-主要积累在表皮细胞和海绵组织中，而栅栏组织中含量最少；反之，K+含量在叶片的栅栏组织细胞中降低幅度较小，因而有利于维持植物光合活性，这也是灌木柳适应盐胁迫的重要特征[25]。

盐胁迫造成的离子毒害主要是Na+和Cl-毒害，这是植物在盐胁迫下首先要解决的问题[12]，植物通过调控盐分在器官或组织特定的区域化分布，减轻盐分对功能器官或组织的伤害，但随着这些区域细胞内盐分的增加，此时单纯利用稀盐的方式不足以将盐分降低到无伤害水平，因此，细胞水平离子区域化也可能是植物避免离子毒害的重要方式之一[19]。植物将盐离子转移到液泡中，可以减少盐离子对细胞质的危害，同时积累于液泡中的盐离子降低了细胞的水势，提高了细胞的保水能力[26,27]。本研究结果也表明，灌木柳将Na+和Cl-截留在茎部，尤其是茎部髓细胞，同时在细胞水平上将Na+和Cl-主要储存在液泡中，以减少盐分对细胞质的伤害，此结论与前期预研究中灌木柳液泡膜H+-ATPase活性增强的结果具有一致性。

综上所述，NaCl胁迫下，灌木柳通过调控离子在植物体内区域化分布，提高对盐胁迫适应性。植株茎对Na+和Cl-起到截留作用，减少盐离子向叶片的运输，保持叶片中较高的K+含量，有利于植株维持植物光合活性及生长能力，且JW2345离子区域化分布调控能力较强，因而其耐盐性较强。在组织水平上，灌木柳茎中离子区域化分布明显，Na+和Cl-主要积累在髓细胞中；同时，液泡对Na+和Cl-的区隔化作用也是柳树避免细胞受盐分毒害的重要机制。

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Effects of salt stress on ionic distribution of shrub willow

ZHOU Peng, ZHANG Min
(Jiangsu Academy of Forestry, Nanjing 211153, Jiangsu, China)

To study the compartmentalized ion distribution in the seedlings of two clones with salt-tolerance, we treated seedlings of shrub willow with 100 mmol·L-1NaCl for 10 d by the method of hydroponics. The results showed that under NaCl stress, K+content decreased in the seedlings, while Na+and Cl-contents increased in salinity. Among the test organs, stems had the highest content of Na+and Cl-, while leaves had the lowest. The transportation selectivity of K+to Na+from root to stem declined, and transportation selectivity of K+to Na+from stem to leaf increased. Compared with salt-susceptible clone JW2367, salt-resistant clone JW2345 had a bigger change range of transportation selectivity of K+to Na+from root to stem and of K+to Na+from stem to leaf, and retained more Na+in root; while accumulated more K+and less Na+in its leaves. All of these suggested that the stronger adjustment ability of the compartmentalized ion distribution was the main reasons for the stronger salt-tolerance of JW2345. Analysised with X-ray electron probe microanalysis, we fined the ion content somewhat differed with different tissues. Na+, K+and Cl-were almost distributed uniformly in all tissues of roots,while in stems, pith cells had the greatest increment of Na+and Cl-，followed by vascular tissue cells and periderm cells. In leaves，palisade tissue cells had the smallest increment of Na+and Cl-and the relative content of K+in palisade tissue cells was higher than that in spongy cells and epidermal cells.The accumulation of Na+and Cl-in the vacuolar was much higher than that in the cytoplasm in the cells of stem pith，and the compartmentalized distribution of ions in the cells of stem pith was also one of physiological adaptation mechanisms of shrub willow to salinity.

salt stress; shrub willow; ionic distribution; selective transportation

S718.43

A

1673-923X(2017)01-0007-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.01.002

2016-02-25

国家自然科学基金“NaCl 胁迫下一氧化氮调控灌木柳液泡膜H+-ATPase的分子机制”（31300515）

周 鹏，硕士，研究实习员 通讯作者：张 敏，副研究员，博士；E-mail：zpnjfu@sina.com

周 鹏，张 敏. 盐胁迫对灌木柳体内离子分布的影响[J].中南林业科技大学学报，2017, 37(1): 7-11, 26.

[本文编校：谢荣秀]