时晓萌 李 超 （山东省夏津县畜牧兽医局 253200）

一起禽腺病毒感染的诊断

时晓萌 李 超†（山东省夏津县畜牧兽医局 253200）

禽腺病毒(Fowl Adenovirus, FAV)作为家禽常见的传染病病原之一，其大多数可在健康鸡、鸭、鹅体内存在并且复制，但是一般不表现临床症状，呈隐性感染[1]。禽腺病毒可被分为I、II和III3个群，I群禽腺病毒(Fowl Adenovirus Group I, FAV-I)具有共同的群抗原，可分为A、B、C、D、E 5个种和12个血清型，能引起家禽心包积液、肝炎、产蛋下降和再生障碍贫血等，形成鸡胚致死孤儿征、鸡包涵体肝炎等病症[2]。

血清4型FAV-I能引起鸡的心包积液-肝炎综合征，该病因最早在巴基斯坦安卡拉地区的一个肉鸡场暴发流行，故又被称为安卡拉病[3]。该病主要危害3～6周龄肉鸡，发病鸡出现精神沉郁、羽毛逆立、排黄色稀粪；剖检可见心包积有淡黄色透明的渗出液；肝脏肿胀、出血、色泽变暗、质地变脆，死亡率可高达20%～80%[4]。

近日笔者收到山东聊城某养鸡场送检病料，通过临床症状和病理剖检观察，初步确定该鸡场发生鸡心包积液-肝炎综合征，进一步通过病毒分离、PCR检测和序列分析，确定该发病鸡场感染爆发了FAV-I。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 山东聊城某养鸡场送检病鸡4只；SPF种蛋购自山东省农科院家禽所SPF鸡场；Taq酶购自北京全式金生物科技有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；T4 DNA连接酶、pMD18-T载体和DNA marker DL2000均购自大连宝生物有限公司；其它试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1.2 剖检特征 将送检的病鸡进行临床剖检，观察并记录其剖检病理变化。

1.3 病毒的分离 取病鸡少量肝脏，匀浆研磨后，加入磷酸盐缓冲液，12000rpm/min，4℃离心10min。取上清用0.22μm滤器进行过滤，滤液经绒毛尿囊膜途径接种9～11日龄SPF鸡胚，放置于37℃温箱孵育24h后观察，剔除死胚，继续孵育3～5d后收获尿囊液，-20℃保存备用。

1.4 病毒核酸提取及PCR检测 按照常规方法[5]提取病毒基因组。根据Genbank中I群腺病毒代表毒株CELO病毒的全基因组序列，设计合成引物：F：5’-ACCTGCCCGAC AAATACAAG-3’, R：5’-TGTTGGGATCCTTTCTGAGG-3’，并交由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。然后取0.1μg的病毒DNA采用20μl的体系进行PCR扩增，具体为：DNA 1μl，5×PCR buffer 10µl，上下游引物各0.4μl，Taq酶0.2μl，dNTPs 1.6μl，灭菌水6.4μl。经94 ℃ 5min 变性，然后94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃ 7 min延长，4℃保存。

1.5 PCR产物的回收、连接及测序 将PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶进行电泳，切下目的片段，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。纯化后的目的片段通过T4 DNA连接酶连接到pMD18-T载体上，送青岛擎科生物技术公司测序。

1.6 序列比对 将测序获得的序列通过NCBI进行Blast比对，分析序列同源性。

2 结果

2.1 病鸡剖检症状 剖检病变主要集中在心脏、肝脏和肾脏。病死鸡有明显心包积液(图1A)，肝脏明显肿大变色，发黄，有坏死点或出血斑(图1B)，肾脏肿大淤血或出血，部分有尿酸盐沉积(图1C)。部分鸡只有继发大肠杆菌感染，出现心包炎、肝周炎症状。

图1 剖检病变观察

2.2 病毒分离及PCR鉴定 病料样品接种SPF鸡胚后收集3～5d后的鸡胚尿囊液，使用内参基因β-actin引物和合成的腺病毒F、R引物对提取的核酸进行扩增，结果得到150bp左右的内参对照片段和320 bp左右的目的条带(图2)。

图2 PCR检测结果。

2.3 序列比对 将所扩增的目的片段(图 2)进行回收纯化，连接到 pMD18-T载体后进行克隆测序，测序结果提交到NCBI数据库中进行核酸比对，结果显示本实验分离到的4株病毒与自2015年以来表现为心包积液-肝炎综合征的禽腺病毒4型核苷酸同源性最高，达100%。

3 讨论

自2015年以来，我国很多省份，如河南、山东、河北、辽宁、安徽、吉林等省的部分地区鸡群暴发了禽腺病毒病，给养殖业造成了严重的经济损失[1,2]。本研究首先通过临床剖检症状，初步判断此次山东聊城某养鸡场发生了禽腺病毒的暴发流行。该病感染后以心包积液、肝脏肿大变性和坏死为主要临床特征，病毒主要感染3～5周玲的肉鸡、肉杂鸡、麻鸡和蛋鸡，发病率较高，死亡率在10%～80%不等，一般在30%左右。为进一步确诊，又进行了实验室诊断，将病死鸡肝脏研磨后接种SPF鸡胚进行病毒分离，利用合成的I群FAdV引物，通过PCR方法和序列比对分析，结果发现，从4只死亡鸡中分离的病毒确为FAdV，这就进一步确诊了此次疫病暴发是由FAdV导致的。证明了临床判断的准确性。目前，国内至今尚没有商品化的疫苗来预防FAdV，发病后对症治疗并及时注射高免血清是主要的治疗手段。在确诊是FAdV感染后，该养鸡场及时注射FAdV高免血清，2～3d后病鸡死亡率出现大幅下降，避免出现严重损失。然而平时加强饲养管理，保持环境卫生，增强生物安全意识，远离传染源、切断传播途径、保护易感鸡群，才能更好的预防该病的暴发。

[1] 罗思思, 谢芝勋, 邓显等. I群禽腺病毒分离鉴定及hexon基因的序列分析[J]. 畜牧与兽医, 2012(1)： 52-56.

[2] 殷震, 刘景华. 动物病毒学(第2版)[M]. 北京：科学出版社, 1997.

[3] 袁万哲, 李玉保, 王建昌等. 鸡心包积液-肝炎综合征的初步研究[J]. 中国兽医科学, 2016, 46(2)： 157-160.

[4] Humboldt CF, Frazier M N. Avian hepatic inclusion bodies of unknown significance. Avian Disease, 1963, 7(4)： 446-450.

[5] Samblook著. 金冬雁, 黎阵枫译. 分子克隆(实验指南)(第2版)[M].北京： 科学出版社, 1996.

S858.3

B

1007-1733(2017)12-0034-02

†并列第一作者

2017-08-06）