刘绍华，白家峰，冉盼盼，马扩彦，许春平

（1.广西中烟工业有限责任公司技术中心，广西 南宁 530001；2.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南 郑州 450000；3.重庆中烟工业有限责任公司技术研发中心，重庆 400060）

美拉德反应时间对烟草花蕾发酵液挥发性香味成分的影响

刘绍华1，白家峰1，冉盼盼2，马扩彦3，许春平2

（1.广西中烟工业有限责任公司技术中心，广西 南宁 530001；2.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南 郑州 450000；3.重庆中烟工业有限责任公司技术研发中心，重庆 400060）

为研究不同美拉德反应时间对烟草花蕾发酵液挥发性香味成分的影响，烟草花蕾经高活性产香酵母发酵后，通过时间调控优化美拉德反应制备烟用香料，并对此香料进行主成分分析以及加香评吸。结果表明：经同时蒸馏萃取提取，美拉德反应8 h样品香味物质有45种，反应12 h样品香味物质有38种，反应16 h样品香味物质有45种，反应20 h样品香味物质有42种，主要包括醇、醛、酸、酯、酮、呋喃和吡啶等。烟草花蕾发酵液经不同美拉德反应时间处理后香味成分主成分分析可知，美拉德反应时间8、12、20 h样品的香味成分有显著差异，美拉德反应时间16、12 h样品的香味成分无显著差异。美拉德反应时间12 h的样品对空白烟进行加香评吸的效果最佳。

产香酵母；美拉德反应；烟草花蕾；优化；主成分分析

美拉德反应是氨基化合物和还原糖之间发生的反应，是形成烟草特征香味的主要途径之一。美拉德反应产物含有大量香味物质，大部分与烟香谐调，能有效改善低次烟草的品质，减少木质杂气，增加烟香，为一类很好的烟用香料。张鹏等［1］基于美拉德反应原理，分析了烟末提取浓缩液美拉德反应时间对烟草薄片质量的改善效果，研究发现美拉德强化修饰可有效降低烟末提取液中的不利成分，增加风味致香成分，如糠醛、巨豆三烯酮等醛酮类物质；减少薄片杂气和木质气。王莹［2］对美拉德反应体系的工艺，最佳美拉德反应产物的分离鉴定、对比分析及其卷烟加香应用，结果发现在烤烟型卷烟中添加适宜浓度的美拉德反应产物对感官质量有显著的改善作用，可以增补烟香，改善吃味，减轻杂气和刺激性，增强烟气的细腻性、醇和性，使香气更加丰满、协调。程传玲等［3］以山梨糖和脯氨酸为原料，模拟美拉德反应体系，结果显示美拉德反应后的产物利用气-质联用仪对产物进行GC-MS分析，检测到吡啶类等杂环化合物，这些物质是卷烟中的重要香气成分。班强等［4］考察了废烟末烟膏与脯氨酸的美拉德反应，结果表明对最佳美拉德反应产物进行GC/MS分析鉴定，35种产物中包括2-甲基吡嗪、2-乙酰基呋喃、2-吡咯烷酮等对烟草香味有着很好修饰作用的美拉德反应产物，以及烟碱、苯乙烯、香草醛、4，7，9-巨豆三烯-3-酮等加强烟草本香化合物，可以作为烟用香料用于卷烟加香。本试验以打顶废弃的烟草花蕾为原料，经一定条件的发酵处理得到发酵液，通过对发酵液进行不同美拉德反应时间处理，对美拉德反应产物进行加香评吸，同时蒸馏提取香味物质，GC-MS分析以及主成分分析香气成分，旨在探究不同美拉德反应时间对烟草花蕾香料的影响以及美拉德反应产物对卷烟加香的效果，以期对新型烟草香料的制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料云烟87烟草花蕾，由广西中烟工业有限责任公司提供；酿酒高活性酵母；试剂葡萄糖、谷氨酸、磷酸氢二钠、磷二氢钠、3，5-二硝基水杨酸钠、丙二醇、1 moL/L NaoH、1 moL/L H2SO4、二氯甲烷、0.8211 moL/mL乙酸苯乙酯等。

仪器设备：Q-100A3 旗箭粉碎机（上海冰都电器有限公司），HS-4 恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），PL203 电子分析天平（0.0001 g）梅特勒-托利多仪器（上海有限公司），RIGOL UItra-3400紫外分光光度计（河北惠采科技有限公司），DGX-9143 电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛设备有限公司），BIORIDGE卢湘仪TGL-16M离心机，同时蒸馏萃取装置（郑州科技玻璃仪器厂），6890 /5973 气相色谱/质谱联用仪（安捷伦科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 产香酵母活化 将产香酵母用35～40℃的水活化15～20 min，然后温度降至34℃以下活化1～2 h。将10 g产香酵母放入250 mL锥形瓶中，加入100 mL 35～40℃无菌水在32℃水浴锅中活化2 h，备用。

1.2.2 烟草花蕾灭菌处理 将干燥的云烟87烟草花蕾粉碎，过0.250 mm孔径筛网，置于500 mL锥形瓶中以料液比为1∶10比例加入200 mL蒸馏水。水浴锅中沸水浴30 min达到灭菌效果。

1.2.3 美拉德反应处理 向发酵后4个样品中各加入20 mL丙二醇调pH7用封口放入70℃烘箱分别反应8、12、16、20 h。

1.2.4 同时蒸馏萃取提取香味物质 将美拉德反应产物倒入同时蒸馏萃取装置一端的平底烧瓶中，加入100 mL蒸馏水，用电子调温电热套加热，装置的另一端蒸馏瓶中注入50 mL二氯甲烷，于60℃水浴中加热。当水与二氯甲烷分层开始计时，萃取2.5 h，然后在二氯甲烷萃取液中加入含量为0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯1 mL和无水硫酸钠若干，静置过夜。然后于35～40℃浓缩，浓缩至约1 mL转至样品瓶中，低温密封保存，用于GC/MS定量分析［5-7］。

1.2.5 GC-MS条件及分析 色谱条件：色谱柱为HP-5MS色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm），进样口温度：280℃，分流比10∶1，进样量1 μL载气：氦气，载气流量为：3 mL/min，升温程序为：初起始温度50℃，以4℃/min升至280℃；质谱条件：EI源，接口温度270℃，电子能量：70 eV，四极杆温度：150℃，采集模式 ：扫描［8］；质量扫描范围 ：35～550 m/z。利用Nist11谱库将质谱图中各色谱峰进行检索，同时进行人工解析，对化学成分进行定性分析（匹配度＞80）。采用内标法（内标物0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯）对物质进行定量。挥发性物质含量（μg/g）=（内标物质量×挥发性物质峰面积×1000）/（烟草花蕾质量×内标物峰面积）［9］

1.2.6 主成分分析 采用IBM SPSS Statistics21软件对挥发性物质主成分进行分析［10-13］，根据相关系数列出相关矩阵，计算各主成分的系数及综合得分，并进行排序。根据不同美拉德反应时间的烟草花蕾发酵液有关成分的含量标准化值与特征根、特征向量，计算各主成分值，并以此作散点图。

1.2.7 感官评价 待加香评吸的烟来自广西中烟公司的空白烟，每个试验处理为不同美拉德反应时间处理烟草花蕾发酵液后的美拉德放应产物，经离心取2 mL上清，加香后在温度22（±2）℃，相对湿度60（±5）%的恒温恒湿箱中平衡24 h待评吸。取仅加水的空白烟作对照。请广西中烟评吸小组进行感官评吸，评吸小组10人，参照《卷烟 第四部分：感官技术要求》（GB 5606.4—2005） 对卷烟样品进行感官评价分析［14］。

2 结果与分析

2.1 烟草花蕾发酵液经不同美拉德反应时间处理后GC-MS数据分析结果

发酵后的样品进行4个时间梯度的美拉德反应，经同时蒸馏萃取提取香味物质GC-MS分析结果见表1。

表1 美拉德反应香味物质含量

（续表1）

（续表1）

从表1可以看出，发酵后的烟草花蕾经不同美拉德反应时间处理，利用蒸馏萃取技术提取的挥发性成分共计79种。挥发性香味物质含量及种类差异很大，其中经过美拉德反应8 h样品香味物质有45种，反应12 h样品香味物质有38种，反应16 h样品香味物质有45种，反应20 h样品香味物质有42种，主要包括醇、醛、酸、酯、酮、萜稀类，以及呋喃、吡啶苯胺等。烟草花蕾在发酵后经不同美拉德反应时间处理后，含有各自特有的香味成分，美拉德反应8 h处理特有的香味物质有硬脂酸、辛酸、亚麻酸、顺式-9-十八醛烯、1-十九烯、2-甲基-6-乙基苯胺5种；美拉德反应12 h处理特有的香味物质有金合欢醇、十二烷硫醇、甲基壬基甲酮、1-二十三稀、1-二十六碳稀、（-）-a-芹子稀、g-古芸稀、十八烷基乙烯基醚8种；美拉德反应16 h处理特有的香味物质有反-2，6-壬二醛、乙酸苏合香酯、硬脂酸甲酯、（E）-9-十八烯酸甲酯、（E，E）-1，3，5-十一三烯、反，反，顺-1，3，5，8-十一碳四稀、（3E，5Z）-1，3，5-十一烷三烯、2，3，6-三甲基吡啶、2，3-联苯吲哚9种；美拉德反应20 h处理特有的香味物质有对甲基苯甲醛、邻甲基苯乙酮、4-癸烯、2-乙酰基吡咯4种。从表1还可以看出，香气总量由高到低依次为美拉德反应8、12、20、16 h样品，最高达787.75 μg/g。美拉德反应12 h样品中的肉豆蔻酸、二氢猕猴桃内酯、大马士酮、吲哚含量较美拉德反应8、16 h样品中含量下降；棕榈酸甲酯、巨豆三烯酮、三环烯、烟草烯、2-正戊基呋喃含量较美拉德反应8、16 h样品中含量上升。

2.2 主成分分析

利用 IBM SPSS Statistics 21 软件因子分析模块中的降维分析，对发酵液不同美拉德反应时间处理后的79种挥发性成分进行主成分分析，得到主成分载荷矩阵（表2）、特征值和贡献率（表3）。

表2 主成分载荷矩阵

（续表2）

表3 3种主成分的特征值和贡献率

从表2可以看出，苯乙醛、肉豆蔻酸、正十五酸、苯乙醇、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮、反式-5-甲基-3-（1-甲基乙烯基）-环己烯、棕榈酸甲酯、氧化石竹烯、11-烯酸、软脂酸、棕榈油酸、大马士酮、三环烯、1-十八烯、巨豆三烯酮、4-乙烯基-4-甲氧基苯酚、麦由酮、乙酸苏合香酯、硬脂酸甲酯、（E，E）-1，3，5-十一三烯、（3E，5Z）-1，3，5-十一烷三烯、反，反，顺-1，3，5，8-十一碳四稀、2，3，6-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡啶、反-2，6-壬二醛、（E）-9-十八烯酸甲酯、2，3-联苯吲哚、亚油酸、2-壬酮、甲基庚烯酮30种物质在主成分1中有较高矩阵，即主成分1反应上述30种指标的信息；邻甲基苯甲醛、二氢猕猴桃内酯、1-二十七烷醇、间甲基苯乙酮、寸拜精、14-甲基-（Z）8-顺-11-十六碳烯醛、辛酸、2-甲基-6-乙基苯胺、顺式-9-十八醛烯、硬脂酸、1-十九烯、吲哚、亚麻酸、肉豆蔻醛、反式-13-十八烯酸、N-乙基-2-甲基苯胺、（1S，2E，4S，5R，7E，11E）-瑞士五针松-2，7，11-三亚乙基四胺-4，5-二醇、N-（2-三氟甲基苯）-3-吡啶甲酰胺肟、邻苯二甲酸二丁酯19种物质在主成分2中有较高矩阵即主成分2反应上述19种指标的信息；（-）-a-芹子稀、金合欢醇、十二烷硫醇、甲基壬基甲酮、1-二十三稀、1-二十六碳稀、十八烷基乙烯基醚、g-古芸稀、1，5，9-三甲基 -12-（1-甲基乙基）-4，8，13，-环十四烷三烯-1，3-二醇、2-正戊基呋喃、3-（4，8，12-三甲基十三烷基）呋喃11种物质在主成分3中有较高矩阵即主成分3反应上述11种指标的信息。

由表3可知，主成分1、2、3的累积贡献率达到100.000%，因此，79种挥发性成分可以用主成分1、2、3进行主成分分析。

根据表1中4个不同美拉德反应时间处理样品的79种香气成分的相对含量、表3中前3个主成分的特征值和表2中79种香气成分的载荷值计算出4个样品中的第一、第二和第三主成分值，然后以第一主成分为Z坐标，第二主成分为X坐标，第三主成分为Y坐标，做散点图（图1）。由图1可知，4个样品根据距离远近分为3个区域，其中美拉德反应时间处理8、20 h的样品距离较远，美拉德反应时间处理12、16 h的样品距离较近。

图1 美拉德反应时间处理样品的主成分分散图

图2由79种香气成分（与表2香气成分相对应）的第一主成分为坐标、第二主成分为坐标、第三主成分为坐标作散点图，见图2。由图2结合图1、表2可知，影响美拉德反应时间8 h样品的香气组成的香气成分主要集中在第一主成分的正半轴、第二主成分的正半轴、第三主成分的负半轴，按影响力大小依次为辛酸（49）、吲哚（54）、顺式-9-十八醛烯（51）、2-甲基-6-乙基苯胺（50）、己二酸二辛酯（79）、寸拜精（47）；影响美拉德反应时间20 h样品的香气组成的香气成分主要集中在第一主成分的正半轴、第二主成分的负半轴、第三主成分的负半轴，按影响力大小依次为反式-5-甲基-3-（1-甲基乙烯基）-环己烯（6）、棕榈酸甲酯（7）、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮（5）、反油酸（34）、己酸（35）、对甲基苯甲醛（33）。

图2 79种挥发性成分的主成分散点图

2.3 烟草花蕾发酵液经不同美拉德反应时间处理后的感官品质分析

烟草花蕾发酵液经不同美拉德反应时间处理后的感官评吸结果见表4。从表4可以看出，经过不同美拉德反应时间处理后的样品与对照相比，光泽无变化，而香气、谐调性、杂气、刺激性和余味均有不同程度变化。采用美拉德反应8 h的样品对空白烟进行加香，与对照相比，香气质、协调性、刺激性和余味降低，杂气提升；采用美拉德反应12 h的样品对空白烟进行加香，与对照相比，杂气和刺激性降低，香气质、协调性和余味提升；采用美拉德反应16 h的样品对空白烟进行加香，与对照相比，协调性、杂气和刺激性降低，香气质、和余味提升；采用美拉德反应20 h的样品对空白烟进行加香，与对照相比，香气质、协调性、杂气和余味降低，刺激性提升。综上美拉德反应12 h的样品对空白烟进行加香评吸的效果最佳。

表4 不同美拉德反应时间处理后的感官评吸结果（分）

3 结论与讨论

以废弃烟草花蕾为原料，发酵后得到的烟草花蕾发酵液经不同美拉德反应时间处理后香味成分含量变化较大，美拉德反应8 h的样品挥发性物质总含量达787.75 μg/g，美拉德反应16 h的样品挥发性物质总含量达573.07 μg/g；香味物质种类变化不大，经过美拉德反应8 h样品香味物质有45种，美拉德反应12 h样品香味物质有38种，美拉德反应16 h样品香味物质有45种，美拉德反应20 h样品香味物质有42种；烟草花蕾发酵液经不同美拉德反应时间处理后香味成分主成分分析可知，美拉德反应时间8、12、20 h样品的香味成分有显著差异，美拉德反应时间12、16 h样品的香味成分无显著差异；从不同美拉德反应时间处理后的感官评吸总分来看，美拉德反应时间12 h的样品对空白烟进行加香评吸的效果最佳。

关于美拉德反应的研究很多，但基于烟草花蕾发酵液美拉德反应的研究还没有。大田中大量打顶的烟草花蕾被废弃，烟草花蕾的再利用很大程度上扩大了烟草来源。利用废弃的烟草花蕾制备烟用香料有很大的发展前景，烟草花蕾经发酵后含有更多的糖和氨基酸更有利于美拉德反应，可以改善烟草香气。

［1］ 张鹏，于静洋，龙章德，等. 美拉德反应改善烟草薄片质量的应用研究［J］. 食品与机械，2016，32（3）：39-44.

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［14］ 中国国家标准化管理委员会. 卷烟 第四部分：感官技术要求GB5606. 4-2005［S］. 北京：中国标准出版社，2005．

Effects of Maillard reaction time on volatile aroma components in tobacco bud fermentation broth

LIU Shao-hua1，BAI Jia-feng1，RAN Pan-pan2，MA Kuo-yan3，XU Chun-ping2
（1.Technical Center of China Tobacco Guangxi Industrial Co.， Ltd，Nanning 530001，China ；2.College of Food and Biology Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China；3.Technical Center of China Tobacco Chongqing Industrial Co.， Ltd，Chongqing 400060，China）

In order to investigate the effects of Maillard reaction time on the aroma of tobacco bud fermentation broth，the tobacco flavor was prepared and optimized by Maillard reaction time control after the tobacco bud was fermented by high-active aroma-producing yeast，and the flavor was analyzed by principal component analysis and sensory evaluation. The results showed that: by simultaneous distillation and extraction，the kind of aroma components in the flavor sample of 8 h Maillard reaction was 45，and the kind of aroma components in the flavor sample of 12 h Maillard reaction was 38，and the kind of aroma components in the flavor sample of 16 h Maillard reaction was 45，and the kind of aroma components in the flavor sample of 20 h Maillard reaction was 42，including alcohols，aldehydes，acids and esters，ketones，furans and pyridine etc. After the tobacco bud fermentation broth treated by Maillard reaction with different time，flavor components were analyzed by principal component analysis and it showed that there were significant differences among three samples of aroma components of Maillard reaction time of 8 h，12 h，and 20 h，and no significant difference among three samples of aroma components of Maillard reaction time between 16 h，and 12 h. By sensory evaluation，it showed that by flavoring into blank cigarette，the sample of aroma components of Maillard reaction time of 12 h was the best.

Saccharomyces cerevisiae；Maillard reaction ；tobacco bud ；optimization ；principal component analysis

TS49

A

1004-874X（2017）08-0096-10

刘绍华，白家峰，冉盼盼，等. 美拉德反应时间对烟草花蕾发酵液挥发性香味成分的影响［J］.广东农业科学，2017，44（8）：96-105.

2017-06-04

广西中烟合作项目（20141011）

刘绍华(1962- )，男，博士，研究员，E-mail：lshaohua18@163.com

许春平（1977-），男，博士，教授，E-mail：xuchunping05@163.com

（责任编辑 白雪娜）