官玲亮，夏奇峰 ,2，庞玉新，于福来，黄梅，陈振夏



水杨酸和茉莉酸甲酯对艾纳香叶片左旋龙脑与总黄酮含量的影响

官玲亮1，夏奇峰1 ,2，庞玉新1，于福来1，黄梅1，陈振夏1

(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室/海南省艾纳香工程技术研究中心，海南 儋州 571737；2.贵州大学生命科学学院/贵州省中药材重点实验室，贵州 贵阳 550025)

以艾纳香为试材，用水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(各设浓度10、1、0.1、0.01 mmol/L)分别喷施艾纳香叶片(嫩叶、成熟叶、老叶)，以喷施去离子水为对照，探索不同浓度SA、茉莉酸甲酯(MeJA)对艾纳香叶片中左旋龙脑(L–龙脑)和总黄酮含量的影响效果。结果表明：除10 mmol/L MeJA处理外，其他浓度的MeJA处理艾纳香嫩叶后，L–龙脑含量均在72 h达到最大值；用1.0 mmol/L MeJA处理成熟叶，L–龙脑在72 h达到最大值(3.043 mg/g)，显著高于对照；除0.01 mmol/L MeJA处理外，用其他浓度的MeJA处理嫩叶，总黄酮的含量均在48 h达到最大值；用1.0 mmol/L MeJA处理老叶，总黄酮含量在72 h达19.246 mg/g；用0.01 mmol/L SA处理成熟叶、老叶，L–龙脑的含量在72 h时分别为2.418、2.034 mg/g，与对照差异达显著水平；用0.1 mmol/L SA处理嫩叶、成熟叶、老叶，总黄酮含量在24 h较高，分别为6.287，8.172、11.827 mg/g。综合本研究结果，1 mmol/L的MeJA对艾纳香叶片中L–龙脑和总黄酮的合成均具有较好的促进作用，且在处理后72 h艾纳香叶片中L–龙脑和总黄酮含量相对较高；0.01 mmol/L SA对艾纳香叶片中L–龙脑和总黄酮含量的积累具有较好的效果，处理后，艾纳香叶片中L–龙脑含量在72 h较高，总黄酮含量在24 h较高。

艾纳香；水杨酸；茉莉酸甲酯；L–龙脑；总黄酮

艾纳香()为菊科艾纳香属多年生木质草本植物，是提取天然冰片(艾片)的主要来源[1]。艾纳香具有镇痛、发汗、祛风除湿、祛痰止咳、通经止血等功效，在黎族、苗族、壮族等少数民族地区有着广泛的应用，是一种重要的民族药物[2–6]。

左旋龙脑(L–龙脑)是艾纳香主要的药用成分。L–龙脑和艾油的含量受环境因素[7]、品种[8]以及栽培措施[9]等的影响较大。本课题组前期的研究表明，土壤因子对艾纳香中L–龙脑活性成分含量也具有不同程度的影响[10]。黄酮类化合物是药用植物中的重要活性成分，具有多种药理活性，如抗癌、抗氧化、抗炎等[11–13]。5,3',5–三羟基–7–甲氧基二氢黄酮是存在于艾纳香中的重要的黄酮类化合物，又被称为艾纳香素，是艾纳香主要的活性成分之一[5]。许实波等[14]研究表明，艾纳香素对肝损伤有保护作用，能够促进肝细胞药源性损伤的修复，提高肝细胞的再生活力。

植物的次生代谢产物能在一些外源诱导因子的作用下大量产生[15–16]。水杨酸(SA)与茉莉酸甲酯(MeJA)是与抗损伤相关的植物激素，能够激发防御信号转导通路中相关基因的表达[17–20]。本研究中，以艾纳香为试材，采用不同浓度的SA和MeJA喷施艾纳香的叶片，研究艾纳香叶片中L–龙脑和黄酮含量的变化，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1　材料

供试材料为种植于海南省儋州市中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所南药种质资源圃一年生的艾纳香()。

主要试剂：L–龙脑标准品(Alfa Aesar，纯度＞98.0%)；芦丁标准品(中国食品药品检定研究院，批号100080–200707，纯度92.5%)；水杨酸甲酯(天津光复精细化工研究所，纯度＞99.5%)；乙酸乙酯(广州友联化学试剂有限公司，分析纯)；水杨酸(Sigma，纯度＞99.9%)；茉莉酸甲酯(Sigma，纯度＞99.9%)；亚硝酸钠(NaNO2)、硝酸铝(Al(NO3)3·9H2O)、氢氧化钠(NaOH)、乙醇均为国产，分析纯试剂。

主要仪器设备：安捷伦7890A气相色谱仪；Sartarius CPA225D分析天平；KQ–500DB型超声仪；UNICO2012–PCS紫外分光光度计。

1.2　方法

参照文献[20]中的方法，将SA和MeJA均配制成10、1、0.1、0.01 mmol/L的溶液。

选择长势良好、一年生的艾纳香为试验材料，用上述不同浓度的SA和MeJA分别均匀喷施不同艾纳香的整株叶片，以喷施去离子水为对照(CK)。每种生长调节剂的每个浓度喷施3株，共24株。重复3次。

根据预备试验结果，艾纳香外源喷施水杨酸和茉莉酸甲酯后，24~72 h总黄酮和L–龙脑含量变化较明显。为此，本研究中从处理结束后24、48、72 h采样。同一植株分嫩叶(植株顶端未完全展开的黄白色的幼嫩叶片)、成熟叶(植株中部已完全长大的深绿色的叶片)、老叶(植株下方叶缘发黄的卷曲叶片)采集。

将采集的艾纳香叶片迅即置于研钵中加液氮研磨成粉，精密称取研磨粉末2 g，置于50 mL离心管中，加入25 mL乙酸乙酯，于40 kHz的超声条件下提取30 min，冷却，过滤，取1 mL滤液至10 mL容量瓶中，加入1 mL内标液，用乙酸乙酯定容，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.3　测定指标与方法

采用气相色谱法测定L–龙脑含量。色谱柱为HP–5石英毛细管(0.32 mm×30 m，0.25 μm)；以 80 ℃为起始温度，保持2 min，以5 ℃/min升温至100 ℃，再以20 ℃/min升温至200 ℃；进样口温度为220 ℃；FID检测器温度为240 ℃；进样量为0.6 μL，不分流。

总黄酮含量的测定参照文献[15]的方法进行。

数据采用SPSS 11.0软件进行统计分析。

2　结果与分析

2.1　MeJA处理后艾纳香叶片中L–龙脑和总黄酮含量

由表1可以看出，除10 mmol/L MeJA处理外,其他浓度处理艾纳香嫩叶的L–龙脑含量均在72 h达到最大值。浓度为1.0 mmol/L MeJA处理成熟叶中L–龙脑在72 h达到最大值(3.043 mg/g)，显著高于对照。各浓度的MeJA处理老叶后，其L–龙脑含量均随时间的增加呈上升趋势，与对照相比，均无明显差异。从表1可见，不同浓度的MeJA均能促进艾纳香叶片中L–龙脑的积累，其中以浓度为1 mmol/L的MeJA的效果较好。

除0.01 mmol/L MeJA处理外的其他浓度的处理，嫩叶中总黄酮的含量均在48 h达到最大值，之后呈下降趋势。在48 h时，10 mmol/L MeJA处理嫩叶中的总黄酮含量与对照有显著差异。浓度为0.01 mmol/LMeJA处理对艾纳香成熟叶中的总黄酮含量影响较小。浓度为1.0 mmol/L MeJA处理艾纳香成熟叶中的总黄酮含量在72 h达最大值，为10.667 mg/g；浓度为10 mmol/L MeJA处理，在24 h成熟叶中总黄酮含量比对照低，之后迅速增加，48ｈ达最大(10.268 mg/g)。与其他浓度的MeJA处理相比，浓度为1.0 mmol/LMeJA处理，对老叶中总黄酮含量的影响较大，在72h达到最大值，为19.246 mg/g。浓度为10 mmol/L的MeJA处理，虽然能在48 h内促进叶片中总黄酮的积累，但在72 h略有降低。浓度为0.01、0.1 mmol/L MeJＡ处理，对艾纳香老叶中总黄酮积累的影响较小。由此可见，1 mmol/L MeJA 处理促进艾纳香叶片总黄酮积累的效果相对较好。

表1　MeJA处理后艾纳香叶片中L–龙脑和总黄酮的含量

对照中L–龙脑和总黄酮含量在24、48、72 h基本一致，取平均值用于分析；同列不同字母表示在0.05水平上差异显著。

2.2　SA处理后艾纳香叶片中L–龙脑和总黄酮含量

由表2可知，用0.01 mmol/L SA处理艾纳香嫩叶、成熟叶、老叶，其L–龙脑的含量随时间的推进呈增加的趋势，在72 h达最大值，分别为2.365，2.418、2.034 mg/g，且成熟叶和老叶中的L–龙脑含量与对照的差异达显著水平。用0.1 mmol/L SA处理艾纳香嫩叶，其L–龙脑含量在72 h处达最大值，为1.985mg/g。成熟叶和老叶中L–龙脑含量对0.1 mmol/L SA响应规律相似，均在48 h内持续增加，在48 h达峰值，分别为1.836、1.521 mg/g，之后呈下降趋势。1.0、10 mmol/L SA对艾纳香叶片中L–龙脑的积累均有促进作用，但效果不明显。由此可见，0.01 mmol/L SA对艾纳香嫩叶、成熟叶、老叶中L–龙脑含量的促进效果较好。

用0.1 mmol/L SA处理艾纳香嫩叶和成熟叶，艾纳香嫩叶和成熟叶中总黄酮含量在24 h达最大，分别为6.287，8.172 mg/g。用1.0 mmol/L SA处理艾纳香嫩叶和成熟叶，其总黄酮含量在24 h达最大，分别为7.848，8.026 mg/g。对于老叶，除1 mmol/L SA处理外，其余浓度处理老叶中的总黄酮含量在24 h的积累量均显著高于对照，之后逐渐降低。由此可见，0.1 mmol/L SA促进艾纳香叶片总黄酮含量积累的效果较好，且在24 h总黄酮含量最高。

表2　SA处理后艾纳香叶片中L–龙脑和总黄酮的含量

对照中L–龙脑和总黄酮含量在24、48、72 h基本一致，取平均值用于分析；同列不同字母表示在0.05水平上差异显著。

3　结论与讨论

研究[21–22]表明，高浓度的植物生长调节剂可抑制单萜等次生代谢产物的合成。本研究结果表明，适宜浓度的MeJA能促进艾纳香叶片L–龙脑和总黄酮含量的积累。用1 mmol/L MeJA处理艾纳香成熟叶和嫩叶，艾纳香成熟叶和嫩叶中的L–龙脑含量在72 h显著提高。该浓度下，老叶和成熟叶中的总黄酮含量在72 h也显著高于对照。而嫩叶和成熟叶对10 mmol/L MeJA的响应规律表现为48 h内持续增加，随后逐渐降低。喷施10 mmol/L MeJA，艾纳香叶片生长正常，无明显不良反应；而喷施10 mmol/L的SA，艾纳香叶片出现了明显的褐化、卷缩、枯萎现象，表明艾纳香叶片对SA的耐受性低于MeJA。不同浓度的SA对艾纳香总黄酮均有不同程度的促进作用，低浓度(0.01、0.1 mmol/L)比高浓度(1、10 mmol/L)的促进作用更明显，这与前人的研究结果[23]相似。

综合本研究结果，1 mmol/L MeJA对艾纳香叶片中L–龙脑和总黄酮含量的积累均具有较好的效果；0.01 mmol/L SA能促进艾纳香叶片中L–龙脑的积累效果较好，处理后72 h艾纳香叶片中L–龙脑含量较高。0.1 mmol/L SA促进艾纳香叶片中总黄酮含量的积累效果较好，在处理后24 h艾纳香叶片中总黄酮含量较高。

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责任编辑：尹小红

英文编辑：梁 和

The influence of salicylic acid (SA) and methyl jasmonate (MeJA) to concentrations of L–borneol and total flavonoids in leaves of

GUAN Lingliang1, XIA Qifeng1,2, PANG Yuxin1, YU Fulai1, HUANG Mei1, CHEN Zhenxia1

(1.Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, China/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China/Blumea balsamifera Engineering Technology Research Center in Hainan province, Danzhou, Hainan, 571737, China; 2.College of life sciences, Guizhou University/ Key laboratory of traditional Chinese medicine in Guizhou province, Guiyang 550025, China)

L. DC. was used as test material in this study. Salicylic acid (SA) and Methyl Jasmonate (MeJA) with different concentrations (10, 1, 0.1, 0.01 mmol/L of aqueous solution) were sprayed respectively to the leaves of different position, the control was sprayed with water. Then the contents of L–borneol and total flavonoids were determined to explore the response of leaves to different concentrations of SA and MeJA. The results showed that except for the treatment of 10 mmol/L MeJA, the content of L–borneol of the other treatments reached the maximum value at 72 h after the young leaves sprayed with MeJA. The content of L–borneol reached maximum value at 72 h (3.043 mg/g) after the mature leaves sprayed with 1.0 mmol/L MeJA, which was significantly higher than that of the control. Except for the treatment of 0.01 mmol/L MeJA, the total flavonoids of the other treatments reached the maximum value at 48 h after the young leaves sprayed with MeJA. The total flavonoids reached maximum value at 72 h (19.246 mg/g) after the old leaves treated with 1.0 mmol/L MeJA. The L–borneol contents of the treatments of mature leaves and old leaves sprayed with 0.01 mmol/L reached 2.418 and 2.034 mg/g respectively at 24 h, which were significant higher than those of the control group. Compared with other concentrations, 0.1mmol/L SA had higher total flavonoids (young leaves 6.287 mg/g，mature leaves 8.172 mg/g and old leaves 11.827 mg/g ) at 24 h. In conclusion, 1 mmol/L MeJA could effectively promote the synthesis of L–borneol and total flavonoids and 0.01 mmol/L SA was advantageous to accumulate L–borneol.

; salicylic acid; methyl Jasmonate; L–borneol; total flavonoids

S567.23

A

1007-1032(2017)06-0610-05

2017–03–28

2017–05–31

国家自然科学基金项目(81202910)；海南省自然科学基金项目(817263)；海南省中药现代化专项(ZY201410)

官玲亮(1982—)，女，四川内江人，博士，副研究员，主要从事药用植物种质资源评价及次生代谢调控研究，gllgirl123@163.com

投稿网址：http://xb.hunau.edu.cn