邵 兰 赵其第 费洪荣

(泰山医学院药学院，山东 泰安 271016)

酸性染料比色法测定半枝莲中总生物碱的含量

邵 兰 赵其第 费洪荣

(泰山医学院药学院，山东 泰安 271016)

目的 建立半枝莲中总生物碱含量的测定方法。方法 以盐酸小檗碱为对照品，酸性染料作显色剂，采用紫外分光光度法测定半枝莲中总生物碱的含量。结果 酸性染料法的显色条件为加pH 3.5缓冲液至5 ml，加溴甲酚绿5 ml，充分振摇15 min，氯仿萃取2次(5 ml/次)，测定波长为41 nm，在0.064～0.38 mg范围内线性关系良好(r=0.9997) ，平均回收率99.2%，RSD为2.38%，测得半枝莲中总生物碱含量为0.167%。结论 该测定方法操作简单，重复性好、灵敏度高，可用于测定半枝莲中总生物碱的含量。

酸性染料比色法；半枝莲；总生物碱

半枝莲(Scutellaria barbata D. Don)为唇形科黄芩属植物，以全草入药，异名紫连草、韩信草、并头草、牙刷草、通经草等[1]。主要产于江苏、浙江、四川、安徽、陕西、福建、河南、广东等省，具有抗癌、清热解毒、消肿止痛、化瘀利尿、活血祛疲的功效[2-4]，是一种常用的中药。其化学成分主要有黄酮类、生物碱、酚类、有机酸、甾醇、多糖等[5-8]，其中生物碱是其主要的活性成分之一，具有抗肿瘤的作用[9-10]。

目前文献报道关于半枝莲中生物碱的含量测定方法有紫外分光光度法、酸碱滴定法、高效液相色谱法[11]，酸碱滴定法误差准确度低；高效液相色谱法只能测定某种生物碱的量；紫外分光光度法以盐酸小檗碱为对照品，348 nm下测定，该方法只能同时测定有紫外吸收的成分，很难准确测定总生物碱的含量。本研究根据酸性染料的阴离子与生物碱阳离子形成有颜色的络合物的原理，紫外分光光度法测定有色络合物的量，从而确定总生物碱的含量，为半枝莲中生物碱类成分的开发和利用提供了科学的理论依据，同时也为半枝莲进一步的开发和利用提供参考。

1 仪器和试剂

759系列紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；FC-104 电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司)；MIK-PH100便携式pH计(杭州美控自动化技术有限公司)；半枝莲(山东泰安鸿康大药房)；盐酸小檗碱对照品(上海同田生化技术有限公司，批号09030522，纯度98%)；其它试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1实验溶液的制备

2.1.1pH 3.8溴甲酚绿染料溶液的配制 取1.60 g无水醋酸钠，加入90 ml水使溶解，用冰醋酸调节pH至3.5。取溴甲酚绿约50 mg，加入0.05 mol/L氢氧化钠溶液2 ml至超声波仪器中10 min溶解后，再加入pH 3.8的醋酸-醋酸钠缓冲液至100 ml，备用[8]。

2.1.2对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，用pH 3.5醋酸-醋酸钠缓冲液配制浓度为0.32 mg/ml的对照品溶液，备用。

2.1.3样品溶液的制备

取半枝莲2 g，加入6%盐酸∶甲醇(1∶9)溶液50 ml，40 ℃超声提取3次(30 min/次)，减压抽滤，合并滤液，回收甲醇，烘箱干燥，溶于10 ml pH 3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，备用。

2.2最大吸收波长的测定

精密量取盐酸小檗碱对照品液及供试品液1 ml分别置于2个分液漏斗中，分别依次加入pH 3.8的醋酸-醋酸钠缓冲液5 ml、pH 3.5的溴甲酚绿染料溶液5 ml，充分振摇15 min后氯仿萃取2次(5 ml/次)，合并氯仿溶液并稀释至25 ml，无水硫酸钠脱水，随行试剂为空白，分别用紫外可见分光光度计在200～600 nm下扫描，样品和对照均在418 nm下有最大吸收。见图1。

图1 标准品及样品的紫外吸收光谱图

2.3最佳缓冲液pH的选择

pH对生物碱与溴甲酚绿染料形成络合物的稳定性影响较大[12]。本实验考察了pH值为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液对生物碱含量测得的影响。精密量取盐酸小檗碱对照品液2 ml分别置于分液漏斗中，分别加入pH为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0的缓冲液5 ml， 溴甲酚绿染料溶液10 ml，充分振摇，静置15 min后氯仿萃取随行试剂作空白，按照2.2项下的方法依次测定。结果不同pH下，盐酸小檗碱对照品均在418 nm下有最大吸收，从吸光度值和0～1.5 h内测定的稳定性上来看，pH 3.5时吸光度最大，稳定性最好，故后续实验选用pH值为3.5的缓冲液。结果见表1。

表1 不同缓冲液处理的盐酸小檗碱418 nm下的吸光度

2.4溴甲酚绿染料溶液用量的确定

精密量取盐酸小檗碱对照品溶液0.5 ml，分别置5个分液漏斗中，再分别加入pH 3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液至3 ml，接着分别加入溴甲酚绿染料溶液2 ml，5 ml，7 ml，8 ml，10 ml，随行试剂作空白，按照2.2项下的方法测定418 nm下的吸光度值。结果表明当溴甲酚绿染料溶液用量为5 ml时吸光度最大，故选用溴甲酚绿染料溶液最佳用量为5 ml。

2.3方法学考察

2.3.1标准曲线的制备 分别精密量取盐酸小檗碱对照品液0.2 ml，0.4 ml，0.6 ml，0.8 ml，1.0 ml，1.2 ml置6个分液漏斗中，分别依次加入pH 3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液至5 ml、溴甲酚绿染料溶液5 ml，另取3 ml缓冲液加入随行试剂作空白，按照2.2项下的方法萃取，于418nm下测定吸光度值。以盐酸小檗碱的量(mg)为橫坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求得回归方程为y=2.618x+0.0067(R=0.9997)，结果表明盐酸小檗碱在0.064～0.384 mg内与吸光度线性关系良好。

2.3.2稳定性试验 精密量取盐酸小檗碱对照品液0.6 ml，按2.5同法操作，分别于0 h，0.5 h，1 h，1.5 h，2.0 h依法测定吸光度值，结果RSD为0.55%，表示标准品溶液在2 h内稳定。

2.3.3重复性试验 精密量取半枝莲5份，每份2 g，按2.1.3的方法制备样品溶液，2.2的方法于418 nm下测定，结果表明总生物碱含量的RSD=1.77%(n=5)，表明重复性较好。

2.3.4加样回收率 精密称取已知含量的同一批半枝莲粗粉5份，每份2 g，精密称定，分别加入盐酸小檗碱对照品溶液0.1 ml，分别按2.1.3项下方法制备供试品溶液。分别精确吸取1.0 ml，按照2.2项下方法操作，418 nm 处测定吸光度，平均回收率为99.2%，RSD为2.38%。

2.4样品含量测定

分别取半枝莲粗粉5份，每份2 g，按照2.1.3项下的方法制备样品溶液，每份取1 ml按照2.2项下的方法于418 nm下测定吸光度，计算半枝莲中总生物碱的含量为0.167%(以盐酸小檗碱计)，结果见表2。

表2 半枝莲中总生物的含量

3 讨 论

半枝莲具有抗肿瘤、免疫增强、抗氧化、抗微生物等作用，其中scutebarbatine A、scutebarbatine B、scutebarbatine C等二萜类生物碱为其抗肿瘤作用的主要成分[13]。半枝莲中含有十几种生物碱，其含量测定的方法有高效液相色谱法，但是该方法只能同时测定某种或某几种生物碱的含量。本实验以酸性染料为显色剂、盐酸小檗碱为对照品，测定了半枝莲中总生物碱的含量，方法稳定、重现性较好，为以后半枝莲及其制剂中总生物碱的含量测定提供依据。

本实验考察了总生物碱紫外分光光度法含量测定常用的显色剂溴酚蓝、溴麝香草酚蓝和溴甲酚绿，从显色的稳定性上来看，溴甲酚绿更适合作为半枝莲中总生物碱含量测定的显色剂[14]。上述三种作为显色剂测定总生物碱的含量的方法均属于酸性染料比色法，其基本原理是在适当的pH介质中，碱性成分可以与氢离子结合为阳离子，然后与酸性染料解离出的阴离子定量的结合为有色络合物离子对。生物碱是否完全与染料试剂阴离子结合取决于缓冲液的pH值、缓冲液的用量及酸性染料的用量。故本研究对溴甲酚绿作显色剂的缓冲液pH、缓冲液的用量及溴甲酚绿的用量进行考察，以确定半枝莲中总生物碱含量测定的最佳条件。

[1] 国家中医药管理局.中华本草[M].第2 版.上海: 上海科学技术出版社,1999:210.

[2] Zhi-Jun Dai, Wang-Feng Lu, Jie Gao, et al. Anti-angiogenic effect of the total flavonoids in Scutellaria barbata D. Don[J]. Complementary and Alternative Medicine，2013, 13:150-160.

[3] LI Hui-wei, JIU Mao-lin, GUANG Wen-wu, et al. Scutellaria barbata D.Don induces G1/S arrest via modulation of p53 and Akt pathways in human colon carcinoma cells[J]. Oncology Reports，2013,29: 1623-1628.

[4] LING ZHANG, QIAOYAN CAI, JIUMAO LIN, et al. Chloroform fraction of Scutellaria barbata D. Don promotes apoptosis and suppresses proliferation in human colon cancer cells[J]. Molecular Medicina Reports, 2014,9: 701-706.

[5] XU YM, GUO LW, CHEN JW. Isolation and physico-chemical properties of polysaccharide from the herb of Scutellaria barbata D.Don [J]. Nat Prod Res Develop, 1992, 4(1):1-5.

[6] Dai SJ,Chen M,Liu K,et al. Four new neo-clerodane diterpenoid alkaloids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities[J]. Chem Pharm Bull (Tokyo)，2006, 54(6):869-872.

[7] Dai SJ,Wang GF,Chen M, et al. Five new neo-clerodane diterpenoid alkaloids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities[J].Chem Pharm Bull (Tokyo)，2007, 55(8):1218-1221

[8] Dai SJ,Liang DD,Ren Y, et al. New neo-clerodane diterpenoid alkaloids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities[J]. Chem Pharm Bull (Tokyo)，2008, 56(2):207-209.

[9] Dai SJ,Peng WB,Shen L, et al. Two new neo-clerodane diterpenoid alkaloids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities[J].J Asian Nat Prod Res，2009, 11(5):451-456.

[10] Dai SJ, Peng WB, Shen L, et al.New norditerpenoid alkaloids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities[J]. Nat Prod Res，2011,25(11):1019-1024.

[11] 涂琪顺,蔡光明,何群,等.HPLC法测定半枝莲中二萜类生物碱scutebarbatine B[J]. 中草药, 2008,39(2): 280-282.

[12] 曾宝, 古俊辉, 唐君苹, 等. 酸性染料比色法测定巴豆中总生物碱的含量[J]. 广东药学院学报, 2012, 28(2): 170-172.

[13] Dai SJ,Peng WB,Zhang DW, et al.Cytotoxic neo-clerodane diterpenoid alkaloids from Scutellaria barbata[J]. J Nat Prod,2009, 72(10):1793-1797.

[14] 罗长青,罗北亮.酸性染料比色法测定钩藤的总生物碱含量[J].中药材, 2007, 30(8): 1021-1024.

Determination of total alkaloids in Scutellaria barbata D. Don by acid dye colorimetry

SHAOLanZHAOQi-diFEIHong-rong

(College of Pharmacy, Taishan Medical University, Taian 271016, China)

Objective: To establish a method for the assay of the total alkaloids in Scutellaria barbata D. Don. Methods: Acidic dye colorimetry was used for the determination of total alkaloids in Scutellaria barbata D. Don with berberine hydrochloride as reference substance. Results: Acid dye colorimetric conditions were as follows: pH3.5 buffer to5.0 ml, adding 5ml bromocresol green, extracting for two times (5ml/time) with chloroform, shaking out completely, stewing for 15 min, then determining at the wavelength of 418nm. The concentration of magnoflorine showed good linearity within the range of 0.064～0.384 mg,r=0.9997, and the average recovery ratio was 99.2% with RSD of 2.38%. The total alkaloids content in Scutellaria barbata D. Don was 0.167% determined by this method. Conclusion: This method is simple, highly sensitive, accurate and reproducible, which can be used for determination of the total alkaloids in Scutellaria barbata D. Don

acid dye colorimetry; scutellaria barbata D. Don; total alkaloids

国家级大学生创新创业训练计划项目(201510439082)。

邵兰，女，泰山医学院2013级药学本科专业学生。

费洪荣，E-mail：hrfei@tsmc.edu.cn。

R917

A

1004-7115(2017)12-1361-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.013

2017-09-01)