李润龙+王子璇+何凯科

2016年暑假，我们去湘潭县凤形山学习考察时得知，长沙某大酒店高管左叔叔一直想凭借自己的努力，在凤形山建设有机农场，带动乡亲们致富。他决心告别目前“大农药、大化肥”等技术为主的化学农业模式，转向“动物、植物与微生物完美配合、自动循环”的有机生态农业模式，以保证农产品品质、保护消费者健康，达到“以自然之力恢复自然”“天人合一”的理想境界。

凤形山区域零星分布着一些长势良好的一季稻，主要供村民自己食用，几乎没有施用农药、化肥及除草剂等。

村里长寿老人多，夏天蚊虫少，水稻生长茂盛，很少发生病虫害。而周边几个村子的水稻或多或少都发生过纹枯病之类的病害，造成严重的减产甚至绝收。

我们猜想，凤形山可能具有独特的微生态环境，其中某些有益微生物抑制了水稻病害的发生。因此，有必要筛选经济高效、无副作用的有益微生物，将其应用于有机水稻等农产品病害防治的研究，并探索有益微生物协同防治水稻紋枯病的新途径。

一、拟建生态农场区域环境检测

参考关于有机农场开发与环境相适应的评价方法的相关文献，凤形山区域环境中大气污染物、土壤和水源的重金属及农残等技术指标均达到有机农场的建设要求。

在无人工干预之下，该区域良好的自然环境及微生态系统经过三十多年的自由生长，很可能孕育了一系列有益微生物种群，通过筛选、分离和鉴定，为有机水稻等农产品病害防治和有机农场的建设创造条件。

二、土壤微生物取样及培养

1.土壤微生物取样

采样地点为湘潭县中路铺镇凤形山。通过手机定位在拟建有机农场定位三地块15个点，每个点分四层取样，培养和筛选优势菌株。

2.样品分类

样品分为四类：表层土壤；1cm～10cm土层土壤；10cm～20cm土层土壤；20cm～30cm土层土壤。

3.土壤微生物培养

a.取一定量阴干的土壤，置于灭菌后的研钵内研磨，使土壤颗粒均匀、细腻。称取1g研磨好的土样，加入9mL无菌水用力振荡15min，使土样分布均匀，成为土壤悬液。

b.取1mL土壤悬液滴入灭菌试管中，用无菌水依次稀释成3个浓度梯度，分别为10、100、1 000。分别取土壤稀释液1 000倍液100uL，用灭菌的L型玻璃棒均匀地涂于LB培养基和PDA培养基平板上，于28℃恒温培养48h。

c.挑选各个菌落分离培养。挑取真菌菌落置于PDA平板培养，挑取细菌菌落在LB平板进行划线培养。

结果表明，凤形山荒废多年的平缓坡地土壤中的微生物种类丰富，且菌落种数表层土壤>1cm～10cm土层>10cm～20cm土层>20cm～30cm土层，底层微生物以厌氧真菌为主，好氧细菌很少。

三、微生物菌落分离

通过观察在LB平板和PDA平板上生长的菌落的形态、颜色、生长状况等，共挑选出6种细菌和2种真菌。

其中细菌分别标号为ZN-1、ZN-2、ZN-3、ZN-4、ZN-5、ZN-6，真菌标号为ZN-A、ZN-B。

随后挑选了5株细菌（ZN-1、ZN-2、ZN-3、ZN-4、ZN-6）和2株真菌进行菌种鉴定。

四、微生物菌种鉴定

样品采用Bacterial DNA Kit （Omega）试剂盒进行基因组DNA提取，再经过Sanger测序、建库上机测序，得到的原始序列在Galaxy平台进行质控后获得初处理序列。将获得的初处理序列中含有重叠部分的序列进行拼接，然后将重复序列去除。

将拼接后的序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行核苷酸blast比对，比对结果利用RDP获取物种分类信息。

五、微生物基因序列及分析鉴定

NCBI的比对结果显示，ZN-2基因序列有946个碱基，与芽孢杆菌属的多个种的细菌完全匹配，E-value为0，且覆盖率高达99%，可以确定ZN-2属于芽孢杆菌属。

选择其中相似性较高的分布在芽孢杆菌属的15种细菌，下载它们的基因序列，使用软件MEGA 5.0 绘制系统发育树，发育树显示ZN-2与Bacillus pumilus strain NJ-M2 的亲缘关系最接近，所以推猜测ZN-2属于短小芽孢杆菌Bacillus pumilus。

5株微生物中ZN-1为假单胞菌属，ZN-2、ZN-3、ZN-4、ZN-6分别为短小芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、蜡样芽胞杆；ZN-A、ZN-B及ZN-5有待进一步鉴定。

由此可以初步断定，凤形山独特的有益微生物极有可能是芽孢杆菌菌落。芽孢杆菌属的绝大多数菌种都有很好的安全性，不会对环境造成再次污染。这些有益芽孢杆菌的发现为有机农场的建设及有机水稻的生产奠定了良好的基础。（指导老师：段家铁 蒋银生）endprint