He-Ne激光辐照对黑曲霉A 72的生物学效应

2017-12-01

种子 2017年4期

(内蒙古医科大学计算机信息学院，呼和浩特 010020)

鲍秀珍

(内蒙古医科大学计算机信息学院，呼和浩特 010020)

以黑曲霉为A 72出发菌株，利用氦氖(He-Ne)激光对其单孢子悬液进行诱变育种，探讨激光辐照不同时间对黑曲霉孢子的存活率、菌重、酶活性等生理生化指标的影响。结果表明，不同辐照时间对生理生化指标产生不同的影响，确定激光的最佳辐照时间为6 min。

黑曲霉； He-Ne激光；生物学效应

黑曲霉系子囊菌亚门、丝孢目、丛梗孢科中的一个常见种，是制酱、酿酒、制醋的主要菌种，是生产酶制剂、有机酸的菌种，农业上用作生产糖化饲料。He-Ne激光是一种高效的诱变育种新技术，它的特点是能量密度高、靶点小、方向性好、操作简单、突变率高、辐射损伤轻微、遗传性突变[1]，He-Ne激光诱变微生物育种有广阔的应用前景。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 出发菌株

黑曲霉菌A 72为出发菌，由合肥联合大学提供。

1.1.2 激光器

He-Ne激光器型号HJ-Ⅲ，波长632.18 nm、光斑直径1 mm、输出电流8 mA、输出功率2.4 mW，辐照时间2～20 min，辐照时间成等差数列，公差为2 min。

1.1.3 培养基

孢子培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂120 g，去离子水1 L，pH=6.8；发酵培养基(每份)：玉米芯2.3 g，麸皮0.75 g，无机盐溶液50 mL[2]。

1.2 方法

1.2.1 孢子悬液的制备

把黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂培养基上，培养温度25 ℃，培养时间6 d，用0.9%的无菌氯化钠溶液5 mL将孢子洗脱[3]。

1.2.2 黑曲霉发酵

用适量的无菌水洗脱成熟的孢子斜面，接种于50 mL发酵培养基的三角瓶中，30 ℃培养120 h[3]。

1.2.3 3种保护酶活性的测定

POD活性的测定参照文献[4]的方法，在波长470 nm下扫描5 min，酶活性大小以光密度的变化速率来表示，SOD活性的测定按季健平[5]的方法。

1.2.4 激光辐照

分别吸取5 mL的孢子悬液于若干个无菌平板上，He-Ne激光照射时间为2～20 min。

He-Ne激光照射后的菌液，用生理盐水梯度稀释并做3个平行，用 10-5、10-6、10-7浓度0.1 mL的菌悬液涂平板，于30 ℃避光培养4 d，计算存活率和正突变率[6]。

2 结果与分析

2.1 激光辐照对黑曲霉孢子存活率的影响

由图1可知，不同辐照时间对黑曲霉孢子存活率影响不呈线性关系，而是呈现先减小后增大再减小的震荡型曲线变化，辐照时间在6 min时，孢子的存活率最高，为51%，而辐照时间在6 min以上，黑曲霉孢子的存活率迅速下降，当辐照时间为20 min时，孢子的存活率仅为4%。

图1 不同辐照时间对孢子存活率的影响

2.2 激光辐照对黑曲霉孢子正突变率的影响

由图2可知，不同辐照时间对黑曲霉孢子正突变率的影响也呈现震荡型曲线变化，最大正突变率42%的辐照时间为6 min，当辐照时间超过6 min时，孢子的正突变率直线下降，当辐照时间为16，18，20 min时，孢子的正突变率均为0。

图2 不同辐照时间对孢子正突变率的影响

2.3 激光辐照对黑曲霉菌重的影响

由图3可知，不同辐照时间对黑曲霉菌重的影响不呈现线性关系，最佳辐照时间为6 min，实验的各个激光辐照时间对菌重的影响呈现明显的正效应，辐照时间为20 min时，激光辐照对菌重的影响微乎其微。

图3 不同辐照时间对黑曲霉菌重的影响

图4 不同辐照时间对POD活性的影响

2.4 激光辐照对酶活性的影响

由图4至图6可知，不同辐照时间对3种保护酶活性的影响均呈震荡型曲线变化，但不同辐照时间对3种保护酶活性影响的程度不同，POD、SOD、CAT 3种酶在最佳辐照时间6 min时，酶活性的增加幅度分别为104.1%、173.7%、73.9%；在辐照时间大于16 min时，激光对POD活性的影响呈明显的负效应，而SOD、CAT活性影响的负效应出现在14 min以后。

图5 不同辐照时间对SOD活性的影响

3 小结

本研究结果表明，不同辐照时间对黑曲霉的孢子的存活率、正突变率、菌重、酶活性等生理生化指标的影响呈震荡型曲线变化，产生正突变的最佳辐照时间为6 min，此时正突变率为42%，证明激光对黑曲霉细胞具有修复作用，但激光与微生物相互作用的机理研究还不完善，它们之间的一系列反应和反应的中间产物及作用尚待进一步深入研究[7]。本实验结果为诱变育种选育高产黑曲霉菌株提供了理论和实验依据，在工业生产中有现实意义。

[1]薛正莲,秦艳飞,王洲,等.激光复合诱变选育那西肽高产菌及其代谢特性的研究[J].食品与发酵工业,2011(8):122-125.

[2]王军,张伶,金湘,等.N+注入和60Co-r辐照对柠檬酸发酵菌黑曲霉的诱变效应[J].生物技术,2005,15(2):72-74.

[3]鲍秀珍.高压静电场离子束组合诱变木聚糖酶产生菌(黑曲霉菌)的技术研究[D].内蒙古大学,硕士论文,2007.

[4]华东师范大学生物系植物生理教研组主编.植物生理学实指导[M].北京：人民教育出版社,:299-300.

[5]季建平.超氧化物歧化酶超微量快速测定法[J].南京铁道医学院学报,1991,10(1):27-30.

[6]张帝,张庆庆,汤文晶,等.He-Ne激光对红曲霉ZL307的诱变育种[J].安徽工程大学学报，2013,28(4):4-7.

[7]马玲,金湘,毛培宏.低功率He-Ne激光照射黑曲霉的方法与效应[J].生物技术,2007,17(4):59-60.

(本栏目责任编辑：曾勇)

The Biological Effect of He-Ne Laser Irradiation on Aspergillus Niger A 72

BAOXiuzhen

2016-10-27

鲍秀珍(1967—)女，内蒙古通辽人；硕士，讲师，主要从事生物物理研究；E-mail：baoxiuzhen0115@163.com。