胡桂萍　石旭平　管帮富　张国彪　贺望兴　曹挥华　庞博

摘要：为筛选适宜降解联苯菊酯降解菌，采用正交试验对克雷伯氏菌LB-1固体发酵基质进行筛选，在筛选结果的基础上，对LB-1固体发酵条件、储藏条件进行优化，并进行菌剂稳定性测定。结果表明，最佳载体配比为豆饼粉 ∶凹凸棒（90 ∶10）+10%麦麸+7%玉米粉+3%茶渣；菌剂LB-1制备的最佳接种量为15%，最适发酵温度为 30 ℃，最适发酵时间为30 h，最适烘干时间为36 h，此时菌剂的有效活菌数和降解率均最高。同时菌剂在避光、温度不高于25 ℃条件下90 d内可以保持较高降解活性。联苯菊酯微生物菌剂LB-1在优化后固体发酵培养基培养后降解性和稳定性高，可为今后产品的商品化奠定基础。

关键词：克雷伯氏菌；农药降解；联苯菊酯；固体发酵

中图分类号： S481+.8 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0257-04

收稿日期：2016-04-29

基金项目：国家科技支撑计划（编号：20151BBA13042）；公益性行业（农业）科研专项（编号：201303094-08）。

通信作者：胡桂萍（1985—），女，福建龙岩人，博士研究生，助理研究员，研究方向为茶叶副产物资源化开发与利用和茶叶植保。E-mail：hugp__2007@163.com。 目前，以绿色、环保、有效为宗旨的农业污染微生物修复，在农业可持续发展生产中起着越来越重要的作用。国内外学者，对于农业环境中的污染物，如重金属、农药残留、稀土等开展大量微生物修复研究，已获得数百种具有降污效能的功能微生物，对其作用机制也已得到广泛深入的研究和报道，但是对其规模化生产的应用技术相关报道较少，主要是由于缺乏成熟经济的发酵生产工艺。目前，微生物降污剂、农残降解剂、重金属修复剂通常采用液体发酵报道居多，固体发酵报道较少。其中，液体发酵设备要求高、周期短、发酵产物活性强，但成本较高、产品稳定性较差、不易保存；而固体发酵虽产地需求大，发酵周期长，但其发酵材料来源丰富，可以以大量农作物废弃物作为优良的固体培养基，具有生产成本低廉的特点，发酵产品具有易保存及运输等优点[1]，因此固体发酵是未来重要的生物修复剂等功能微生物产业化的技术。一般而言，菌剂的稳定性包括从制备到使用期间活菌数的变化速度和程度，这是评价菌剂质量的重要参数[2]，而对于降污剂菌制剂通常则以有效活菌数和降解效能为衡量发酵优劣的核心指标[3]。研究表明，在固体发酵过程中，除了温度、含水量、pH值、传质等因素对发酵质量关系密切[4-6]，基质特性也对微生物固体发酵的质量和产量起关键作用[7]。微生物固体发酵的基质组成结构，不仅关系微生物在发酵过程中供给的养分状况，其颗粒大小等直接影响到微生物发酵过程中氧气的供给速度和水分含量[8]。对功能微生物发酵成分和发酵条件的优化不仅可以减少发酵成本，而且可提高发酵产物的数量和质量，使得功能微生物的研究不局限于理论研究，加速其应用推广。

微生物降解菌对环境中的污染物、有毒有害物质均有很好的修复和改良作用，具有很好的应用前景。但是，目前微生物降解菌主要局限于菌种生物特性和降解特性及机理方面，而在实践中应用的案例鲜见报道，缺少切实可行的发酵技术。因此，本研究根据前期研究结果获得联苯菊酯降解菌，克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）LB-1[9]，从联苯菊酯降解菌株实际应用方面出发，使用廉价农产品原料和农业副产物，豆饼粉、麦麸、玉米粉并首次添加茶渣作为发酵基质进行菌株固体型菌剂制备材料及保存条件进行研究，从而为联苯菊酯降解菌克雷伯氏菌LB-1产业化应用提供理论参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌株

菌株LB-1为克雷伯氏菌，保存于江西省蚕桑茶叶研究所微生物菌种库。

1.2 药品和试剂

联苯菊酯标准品：纯度99.8%（由福建省农业厅农产品质量检测中心提供），丙酮、石油醚、无水硫酸钠。

1.3 培养基

LB培养基[10]：10.0 g蛋白胨；5.0 g酵母提取物；10.0 g NaCl，加水定容至1 L，pH值为7.0～7.2。配制相应的固体培养基须加入1.5%琼脂粉。

基础无机盐（MSM）培养基[11-12]：1.5 g Na2HPO4·12H2O，1.5 g KH2PO4，1.0 g NH4NO3，0.2 g MgSO4·7H2O，0.01 g CaCl2·2H2O，0.001 g FeSO4·7H2O，0.050 g酵母提取物，加蒸馏水定容至1 L，pH值7.0～7.2。

1.4 不同混合载体的筛选

将麦麸、锯末、茶渣、玉米粉、豆饼粉按一定比例（质量百分比）配成混合载体，121 ℃灭菌2 h，冷却后按1 ∶1（体积比）接种LB-1种子液。25 ℃通风发酵培养24 h，通风烘干48 h，研成粉末，定时取样测定。结果用有效菌数表示，确定最佳混合载体配方组成。

1.5 载体组合优化

以凹凸棒土和豆饼粉混合物为载体基料，分别以麦麸、茶渣、玉米粉作为添料按照质量比添加到基料中，混合后，121 ℃ 灭菌2 h，冷卻后按照体积比（1 ∶1）的量接种LB-1种子液。25 ℃通风发酵培养36 h，后烘干30 h，研成粉末，定时取样测定。通过4因素3水平进行优化载体最佳组合配比（表1），结果用有效活菌数和降解率共同表示。

1.6 菌剂制备工艺条件优化

以优化后的载体组合进行菌剂制备最佳工艺条件优化，分别通过单因素试验分析接种量（10%、15%、20%、25%、30%）、发酵温度（20、25、30、35、40 ℃）、发酵时间（18、24、30、36、42、48 h）、烘干时间（10、15、20、25、30 h）对菌剂有效活菌数和降解率的影响。endprint

1.7 菌剂储藏条件的优化

比较菌制剂分别在有光（透明玻璃瓶）、黑暗避光（避光棕色玻璃瓶）以及在不同储藏温度下放置30 d后的有效活菌数和降解率。

1.8 菌剂稳定性验证

将制备好的菌剂分别在室温25 ℃條件下保存，分别在处理后10、30、45、60、75、90、105、120 d取样测定有效活菌数和降解率，检测菌剂的稳定性。

1.9 有效活菌数检测方法

有效活菌数采用菌落计数方法，采用稀释平板涂布法，每个稀释度做3个重复，培养基为LB培养基，25 ℃培养24 h，进行菌落计数。

1.10 降解率测定方法

菌剂对联苯菊酯降解率的测定参照胡桂萍等方法[13]，挑取菌落计数后平板上的单菌落在LB培养基中活化24 h，然后用缓冲液清洗，制备菌悬液。然后按照10%的接种量，接入含有50 mg/mL的联苯菊酯无机盐培养基中，150 r/min培养96 h后取30 mL添加农药的培养液，分别加入60 mL丙酮，采用超声波提取法提取（2×15 min）。提取液经铺2层滤纸的布氏漏斗减压抽滤，将滤液全部移入500 mL分液漏斗，加入60 mL石油醚，摇匀，振荡30 min，静置，分层，弃下层溶液，取石油醚层溶液，用20 g无水硫酸钠过滤至250 mL圆底烧瓶。分液漏斗和无水硫酸钠用45 mL石油醚分3次洗涤，洗液并入烧瓶滤液中，50 ℃恒温浓缩，将浓缩液全部转入 10 mL 刻度试管，并用3 mL石油醚分3次洗涤圆底烧瓶，定容至5 mL，取2 mL经0.45 μm有机膜注射式过滤器过滤，滤液收集于试管中，以供GC检测。

气相色谱条件：Agilent 6890N（μECD检测器），毛细管柱HP-5，5% Phenyl methyl Siloxane，30.0 m×320 μm×0.25 μm。程序升温：柱箱温度初始80 ℃，保持1 min，运行时间为1 min，第一阶段以10 ℃/min升温到140 ℃，保持 1.000 min，运行时间为8.000 min，第二阶段以20 ℃/min升温到280 ℃，保持18.000 min，运行时间为33.000 min。进样口温度220 ℃，检测器温度330 ℃。载气为高纯氮气 20.0 mL/min，不分流进样，进样量为1 μL。在此条件下测得联苯菊酯2个异构体的保留时间分别为18.304 min。标准曲线y=26 404x-22 012，确定系数为R2=0.995。其中x为联苯菊酯浓度，y为峰面积。采用外标法测定样品中联苯菊酯的含量，求出其降解率。

联苯菊酯降解率=[1-（实测残量/对照实测残量）]×100%。

2 结果与分析

2.1 不同混合载体的筛选

由表2可知，不同混合载体的筛选结果，茶渣和麦麸等6种载体按照排列组合组成A～F共6组混合载体，利用稀释平板涂布相同条件下测定有效活菌数，可见A组合有效活菌数最高，为42.65亿CFU/g，所以采用A组合当中的豆饼粉、麦麸、茶渣、玉米粉、凹凸棒作为混合载体的组成成分。

2.2 载体配比对菌剂制备的影响

试验采用正交试验4因素3水平设计，以L9（34）为正交试验方案，对选用的载体材料混合用量进行了优化，以1 ∶1（载体质量 ∶菌体质量）与发酵干料均匀混合制成小球状，避光常温（25 ℃）放置45 d后测定活菌生物量和存活率。以k值和R值进行统计学分析，k值大，表示在用一个因素中该水平对试验结果影响大，反则小之。R值大，说明该因素对试验结果影响大，反之小。结果（表3）表明，各因素的主次顺序为豆饼粉 ∶凹凸棒>麦麸接种量>玉米粉接种量>茶渣接种量，最佳配方为A3B2C3D3，即豆饼粉 ∶凹凸棒（90 ∶10）+10%麦麸+7%玉米粉+3%茶渣。

2.3 菌剂最佳制备工艺条件

单因素分析菌剂制备工艺条件得到，菌剂有效活菌数随着接种量增加而上升，菌剂降解率在接种量为15%时为最高，而大于15%的接种量反而使降解率降低（图1）。发酵温度选择在30 ℃时菌体在载体中生长最旺盛，降解率也最高（图2），温度过高或者过低均会影响菌体的生长和降解率。发酵时间为30 h时，即可闻到一种甜醋味，此时的活菌数最高，降解率也最高（图3），表明此时菌体生长已达到最大化，发酵时间过长容易导致菌体缺乏营养供给而细胞死亡，发酵时间不足则会使载体的吸菌量不够，从而导致降解率低。制备好的菌剂选择烘干时间36 h后粉碎，得到的菌剂细度好，活菌数量最高，降解率最高（图4），烘干时间过短，菌剂的含水量大，不易保存，而烘干时间过长，会使菌体大量死亡，降解率变低。因此， 菌剂LB-1制备的最佳接种量为15%， 最适发酵温度为30 ℃，最适发酵时间为30 h，最适烘干时间为36 h。

2.4 菌剂储藏条件优化

将制备好的菌剂分别在透明玻璃瓶和避光棕色玻璃瓶中保存，25 ℃ 放置10 d后取出测定菌剂的有效活菌数和降解率得到（图5），透明玻璃瓶下（光照）菌剂的降解率和有效活菌数明显低于避光棕色玻璃瓶中菌剂。另外，将制备好的菌剂储藏在不同温度下，避光放置30 d后进行降解率和有效活菌数的测定（图6），30 d后，储藏温度在0 ℃时，有效活菌数和降解率为最高；而储藏温度为0～25 ℃时，10 d后菌剂的有效活菌数高于88.00亿CFU/g，降解率保持较高的活性，均高于70%；而当储藏温度高于25 ℃时，10 d后菌剂的有效活菌数和降解率明显下降。上述试验表明，在避光且储藏温度不高于25 ℃条件下，菌剂均可以保持较高的有效活菌数和降解活性。

2.5 菌剂稳定性测定

菌剂在黑暗、25 ℃下储藏90 d，菌制剂均可以保持较高的有效活菌数和较高的降解率（图7），有效活菌数均高于 70亿CFU/g，降解率高于78%；当存放时间为105 d时，菌剂的有效活菌数开始下降，降解率也随着下降；当存放时间为120 d时，菌剂的有效活菌数低于60亿CFU/g，降解率也更低，约60%。说明该菌剂在储藏时间不超过90 d时，稳定性好。endprint

3 讨论

固体发酵技术是微生物实现环境降污和生物修复的重要工具，而发酵基质是固体发酵效果影响的重要因素之一，因此选择生产效率高、功能作用性强的基质和载体是微生物固体发酵的重要前提[13-14]。良好的载体是保证菌株活力的有效措施，對阳光具有吸收和分散作用，可以保护菌制剂免受紫外光线的照射；对水分的吸附，可以一定程度上缓冲干燥的环境条件，适宜载体可以优化并稳定菌剂发挥效果的微生态环境。

本研究通过对现代发酵工业中常用的发酵基质和吸附剂，豆饼粉[15-16]、凹凸棒[17-18]、麦麸[19]、玉米粉[20]以及添加茶树副产物茶渣，采用正交试验优化LB-1固体发酵基质配方，其载体的最佳配比为 ∶豆饼粉 ∶凹凸棒（90 ∶10）+10%麦麸+7%玉米粉+3%茶渣。发酵基质中添加茶渣，一方面是LB-1菌株来源于茶园环境中，而添加茶渣可以优化发酵基质环境，使LB-1发酵环境与其原生境相仿，提高菌株的生长量；另一方面茶渣含有纤维素，多糖，钙、钾、镁常见元素，铁、铜、锰、锌、硒等微量元素，以及多种维生素和矿物元素，是一种良好的微生物基质，有助于发酵菌株的快速生长。目前，农业副产物作为生物发酵基质可以有助于资源综合开发利用。如罗洋等也利用农业副产物橘皮与麦麸进行里氏木霉FS10-C固体发酵[21]。本研究中发酵基质以凹凸棒作为载体，不仅降低制作成本，制作工艺简单，而且极大提高了菌剂的存活率和储藏期，为LB-1固体菌剂的实用生产应用奠定基础。

除了发酵基质种类、基质配比外，菌株接种量、发酵时间、发酵温度、烘干时间等均直接影响到固体发酵产物的数量和质量。本研究通过对固体发酵条件初步分析得到，菌剂 LB-1 制备的最佳接种量为15%，最适发酵温度为30 ℃，最适发酵时间为30 h，最适烘干时间为36 h且分别在这些条件下菌剂的有效活菌数量和降解率均表现较高活性。同时，对于储藏方式进行分析得到，制备好的菌制剂放置于避光条件，且温度不高于25 ℃时，可以保证菌制剂具有良好的活性。另外，对菌制剂的稳定性进行分析，得到菌制剂在90 d内菌剂的质量较好，90 d后菌制剂的有效活菌数和降解率均明显降低，但这与当前微生物肥料或者农药大于6个月有效期还有差距[8]。这可能与菌制剂的含水量、载体种类和含量均有关系，因此，如何通过进一步优化制备工艺和调整发酵基质配方来提高菌制剂产品的质量和保质期是下一步研究重点。

参考文献：

[1]Feng Y L，Shao Y C，Zhou Y X，et al. Production and optimization of monacolin K by citrinin-free Monascus pilosus MS-1 in solid-state fermentation using non-glutinous rice and soybean flours as substrate[J]. European Food Research and Technology，2014，239（4）：629-636.

[2]Thomas L，Larroche C，Pandey A. Current developments in solid-state fermentation[J]. Biochemical Engineering Journal，2013，81：146-161.

[3]王 洋. 阿特拉津降解菌DNS32发酵工艺优化及菌制剂的制备[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2012.

[4]Joshi C，Mathur P，Khare S K. Degradation of phorbol esters by Pseudomonas aeruginosa PseA during solid-state fermentation of deoiled Jatropha curcas seed cake[J]. Bioresource Technology，2011，102（7）：4815-4819.

[5]Gujarathi A M，Sadaphal A，Bathe G A. Multi-objective optimization of solid state fermentation process[J]. Materials and Manufacturing Processes，2015，30（4）：511-519.

[6]Panichikkal A F，Erandapurthukadumana S H，Prakasan P，et al. Optimization of parameters for the production of lipase from Pseudomonas sp.BUP6 by solid state fermentation[J]. Advances in Enzyme Research，2014，2（4）：125-133.

[7]柳 芳，田 伟，李凌之，等. 生防枯草芽孢杆菌SQR9固体发酵生产生物有机肥的工艺优化[J]. 应用与环境生物学报，2013，19（1）：90-95.

[8]刘萌萌，侯志广，赵晓峰，等. 降解嗪草酮微生物菌剂的制备及稳定性研究[J]. 安全与环境学报，2015，15（1）：245-249.

[9]胡桂萍，石旭平，张国彪，等. 茶叶联苯菊酯残留降解菌的筛选与鉴定[J]. 武夷科学，2015，31（1）：147-153.

[10]Sambrook J，Russell D. Molecular cloning：a laboratory manual[M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001.endprint

[11]Wang C，Chen F，Zhang Q，et al. Chronic toxicity and cytotoxicity of synthetic pyrethroid insecticide cis-bifenthrin[J]. Journal of Environmental Sciences-China，2009，21（12）：1710-1715.

[12]Chen S，Luo J，Hu M，et al. Microbial detoxification of bifenthrin by a novel yeast and its potential for contaminated soils treatment[J]. PLoS One，2012，7（2）：e30862.

[13]胡桂萍，趙 艳，刘 波，等. 氟氯氰菊酯降解菌FLQ-5的筛选鉴定及降解特性[J]. 应用与环境生物学报，2013，19（5）：851-856.

[14]徐福建，陈洪章，李佐虎. 固态发酵技术在资源环境中的应用[J]. 生物技术通报，2002（3）：27-30.

[15]Suresh S，Radha K V. Effect of a mixed substrate on phytase production by Rhizopus oligosporus MTCC 556 using solid state fermentation and determination of dephytinization activities in food grains[J]. Food Science and Biotechnology，2015，24（2）：551-559.

[16]张冬冬，姜军坡，朱宝成. 棉花黄萎病生防芽孢杆菌Z-5菌株发酵培养基的优化[J]. 棉花学报，2014，26（1）：10-17.

[17]Fairus M M S，Nur A A，Nadras O. Biodegradation studies of attapulgite clay filled polyvinyl alcohol/modified corn starch blend films：microbial and enzymatic[J]. Advanced Materials Research，2013，747：668-672.

[18]刘金鹏，鞠美庭，姚 欢，等. 改性凹凸棒石黏土对固态发酵氨化秸秆生产动物饲料影响的研究[J]. 南开大学学报（自然科学版），2014，47（2）：52-57.

[19]Muhammad I，Muhammad N，Quratualain Y. Media optimization for amylase production in solid state fermentation of wheat bran by fungal strains[J]. Journal of Cell & Molecular Biology，2012，10（1）：55-64.

[20]郭馨泽，刘 彤，黄忠刚，等. 海洋红酵母的发酵条件[J]. 大连工业大学学报，2015，34（1）：1-5.

[21]罗 洋，滕 应，刘 方，等. 里氏木霉FS10-C固体发酵基质筛选及发酵条件初探[J]. 生物技术通报，2014（3）：111-116. 朱 杰，吴国栋，刘章勇，等. 机械移栽及种植密度对稻田甲烷排放的影响[J]. 江苏农业科学，2017，45（19）：261-264.endprint