刘威+袁芳艳+周丹娜+刘泽文+杨克礼+段正赢+郭锐+蔡行+肖少波+田永祥

摘要：试验构建猪肺炎支原体重组表达质粒pET30a-LppT，通过快速定点突变试剂盒将LppT基因中513、945、1 860、2 547 bp处的A突变为G，使改造后的LppT基因能在大肠杆菌系统中正确表达，IPTG诱导重组蛋白的表达并进行了蛋白纯化，纯化的目的蛋白与佐剂混合、乳化制备免疫原，免疫新西兰大白兔制备LppT蛋白多克隆抗体。SDS-PAGE 分析结果显示，IPTG诱导表达后获得1条特异性蛋白条带，分子质量约为110 ku，与预期蛋白大小一致。可溶性分析结果表明目的蛋白以可溶形式表达于上清中，纯化的蛋白经SDS-PAGE分离后，用制备的LppT多克隆抗体进行Western Blot检测，结果表明制备的LppT多克隆抗体具有较强的特异性。

关键词：猪肺炎支原体；脂蛋白；LppT；多克隆抗体

中图分类号： S858.28 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0220-04

收稿日期：2016-05-27

基金项目：国家重点研发计划（编号：2016YFD0500906）；国家自然科学基金（编号：31502069、31170160）；湖北省农业科学院青年科学基金（编号：2015NKYJJ14）；湖北省农业科学院竞争性计划项目（编号：2016jzxjh030）；湖北省农业科技创新中心资助项目（编号：2015-620-004-001）。

作者简介：刘 威（1985—），男，湖北武汉人，博士，助理研究员，主要从事动物传染病研究工作。E-mail：liuwei85@126.com。

通信作者：田永祥，研究员，主要从事家畜主要疫病生物制剂的研制及综合防控技术研究。E-mail：tyxanbit@163.com。 猪支原体肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的，以猪咳嗽和气喘为主要症状的慢性呼吸道传染病[1]，具有慢性、接触性、高传染性、高发病率和低死亡率的特征。该病广泛分布于世界各地，国外常被称为猪地方流行性肺炎，而在我国常被称为猪气喘病（又称喘气病）[2]。

猪肺炎支原体感染导致猪的生长率下降12%～16%，饲料转化率降低13%～22%，体质量相对减少10～25 kg，商品猪的出栏时间延迟10～30 d[3]；同时还破坏猪的支气管和细支气管纤毛，进而损伤阻挡病原微生物入侵的物理屏障，破坏猪的巨噬细胞，降低机体的免疫清除能力，导致免疫抑制[4]。因此，在临床上猪肺炎支原体常常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪Ⅱ型圆环病毒、猪流感病毒、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌等病原混合感染，增加了当前猪病诊断和预防控制的难度[5-6]。此外，由于猪肺炎支原体是缺少细胞壁的原核微生物，对常作用于细胞壁的抗生素（如β-内酰胺酶类抗生素等）不敏感，猪群一旦被猪肺炎支原体感染，控制和净化将十分困难[7]。据初步统计，全球每年因猪肺炎支原体感染造成的直接经济损失高达2亿美元。可以说，猪肺炎支原体已成为当前严重影响养猪业经济效益的重大疫病，被喻为影响养猪业经济效益的“隐性杀手”。

在以前的研究中，笔者完成了Mhp168株以及体外传代致弱株Mhp168-L的全基因组序列的测定[8]。通过Mhp强弱毒力菌株的比较基因组学分析，筛选出了330个遗传变异位点，分布于123个基因中，进一步分析发现当前国际上报道的Mhp毒力基因（如：P97、P102、P146、P159、P216等）几乎全包括在这123个基因中，其他基因多数功能未知，极可能还存在潜在的未知毒力基因[9]。其中MHP168_424编码的氨基酸序列与M. conjunctivae的膜脂蛋白LppT相似度较高，且均含有1处典型的细菌脂蛋白信号肽区域。M. conjunctivae的LppT蛋白具有体外黏附羔羊关节滑膜细胞的能力，且抗LppT的抗体能有效阻断M. conjunctivae与羔羊关节滑膜细胞的黏附[10]。因此，推测脂蛋白LppT很可能是猪肺炎支原体的一个毒力相关因子。为了进一步研究脂蛋白LppT的功能，本试验拟获得LppT的体外表达产物并制备抗LppT的多克隆抗体，为深入研究LppT的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体及实验动物 MHP168菌株，由江苏省农业科学院兽医研究所提供，笔者所在实验室保存。原核表达质粒pET-30a（+）、大肠杆菌DH5α和BL21（DE3），由湖北省农业科学院畜牧獸医研究所兽医室保存。新西兰大白兔，购自湖北省疫病预防控制中心。

1.1.2 主要试剂 质粒小量提取试剂盒购自TIANGEN公司；琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自Omega公司。DNA聚合酶、核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司。六联组氨酸纯化镍柱、山羊抗兔IgG、HRP-DAB底物显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 分别通过SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测LppT基因的信号肽序列和跨膜区，结果显示LppT不含有信号肽序列，但是存在1处跨膜区域，跨膜区域位于9～31位氨基酸。跨膜区的存在可能导致蛋白的不表达和少量表达，因此在设计引物时去掉了前31个氨基酸的跨膜区域。引物根据Mhp168株LppT基因的核苷酸序列设计（基因登录号：ADQ90626.1）：上游引物LppT-F：5′-TTTGGATCCATGTCCCAAGCCGAAAAAT-3′，下游引物LppT-R：5′-TTTCTCGAGTTATTCCATATATTC GCT-3′。在上、下游引物中分别引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。endprint