胡宗浩　方文婉　周晓彤　何伟

摘要：为寻找研制新型绿色杀线虫生物制剂，首次报道利用灵菌红素（prodigiosin，简称PGN）对混合虫龄松材线虫的生物活性，灵菌红素是一种广泛分布于环境中的黏质沙雷氏菌的次生代谢产物，试验测定不同浓度下灵菌红素的杀虫活性及对松材线虫卵孵化率的影响。离体杀虫试验结果表明，灵菌红素对松材线虫各虫龄段都有较高的生物活性，32 h 时的LC90为（90.24±1.41）mg/L，阳性对照组硫酸铜的LC90为（60.60±1.48）mg/L；在离体虫卵孵化率测定试验中，灵菌红素在较低浓度时就已经表现出较高的生物活性，浓度为9.5 mg/L时，卵的孵化率仅为45.5%，与此同时，对照组的孵化率为97.6%。灵菌红素以其杀虫效率高、环境污染小、来源广泛等优势，在农林业生产中有极好的应用前景。

关键词：黏质沙雷氏菌；次生代谢；灵菌红素；松材线虫；孵化率；杀虫活性；生物活性；应用前景

中图分类号： S432.4+5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0183-04

收稿日期：2016-05-09

基金项目：国家自然科学基金（编号：41301564）；江苏高校优势学科建设工程。

作者简介：胡宗浩（1995—），男，安徽芜湖人，主要从事环境微生物技术研究。E-mail：huzonghao321@126.com。

通信作者：何 伟，博士，副教授，主要从事环境微生物技术研究。E-mail：myway@njnu.edu.cn。 植物寄生線虫是农林作物的主要病原物之一，线虫病在世界各地普遍发生，会对经济造成严重损失。松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）所到之处，松树迅速成片枯萎，对林业生产构成极大的威胁[1]。全世界每年因松材线虫危害对农林业造成的损失超过1 250亿美元[2]。1982年中国首次报道发现由松材线虫引起的松树枯萎病，自此松材线虫在全国迅速扩散，对农林业造成严重的影响[3]。尽管人类在防治上已经作出了巨大的努力，但收效甚微，其危害范围仍在不断扩大[4]。目前对松材线虫病的防治主要通过化学手段，常用的化学药剂有丰索磷、乙拌磷、治线磷、灭线磷、虫线清等，然而丰索磷、乙拌磷、治线磷等都是毒性较高的有机磷农药，对哺乳动物存在严重的安全隐患[5]。所以，目前迫切须要找到一种环境友好型的杀虫剂。

灵菌红素（prodigiosin，简称PGN）是一类天然红色素家族的总称，由多种细菌（沙雷氏菌、假单胞菌）和放线菌（链霉菌）产生的一类次级代谢产物[6]。已有的研究结果显示，灵菌红素在抗真菌[7]、抗原生动物[8]、抗癌[9]、杀虫[10]等方面都具有优良表现。试验发现，灵菌红素在同样浓度下对爪洼根结线虫和香蕉穿孔线虫的杀害作用优于硫酸铜[11]。

本试验通过黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）生产灵菌红素，并对其进行分离纯化和鉴定，进而研究灵菌红素对松材线虫的杀虫活性，为获得新型的绿色杀虫制剂提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

黏质沙雷氏菌为笔者所在实验室保藏，供试松材线虫及其培养所需的灰葡萄孢（Botrytis cinerea）均由南京师范大学微生物所惠赠。

仪器：GWT-P270A恒温培养箱（合肥达斯卡特科学器材有限公司）；722S型可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；YS2-H显微镜（Nikon光学仪器有限公司）；UV-1800PC全波长光谱扫描紫外可见分光光度计（上海美谱达公司）。

1.2 方法

1.2.1 灵菌红素的分离与纯化 将黏质沙雷氏菌涂布于LB培养基上，于30 ℃下培养2 d，用双蒸水洗脱菌体后 8 000 r/min 离心10 min，收集菌体和蛋白沉淀物，按体积比 1 ∶10 在离心沉淀物中加入pH值为3的酸性甲醇溶液，萃取灵菌红素。再通过离心后，获取上清液，将上清液与三氯甲烷以体积比 2 ∶1 混合均匀后，在分液漏斗中萃取。得到灵菌红素的三氯甲烷溶液，以正己烷与乙酸乙酯的混合液（体积比1 ∶1）为流动相，经硅胶柱层析，除去蛋白质、多糖、黄色素等杂质，洗脱液经过旋转蒸发浓缩得到灵菌红素样品。将得到的样品进行紫外全波长扫描鉴定。

1.2.2 线虫的培养 将灭菌后的PDA培养基（马铃薯 200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、1 L 蒸馏水）趁热在超净工作台上制成平板，待冷却，接种灰葡萄孢，在25 ℃培养箱中黑暗培养至菌株长满平皿时备用[12]。在无菌操作台上挑取少量松材线虫，放入培养好的灰葡萄孢培养基中。然后置于25 ℃培养箱中黑暗培养5 d左右，采用布氏漏斗法获得大量混合虫龄的线虫，无菌水洗涤离心后，得到10 000条/mL线虫悬液[13]。

1.2.3 离体杀虫活性测定 以二甲基亚砜（DMSO）为助溶剂，以无菌水为溶剂配制最高浓度为200 mg/L的灵菌红素溶液，并按梯度稀释得到5个浓度的药剂，分别为200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 mg/L（DMSO终浓度应小于1%）；以硫酸铜为阳性对照，浓度梯度相同，为200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 mg/L；以1% DMSO水溶液为对照组（CK）。每个浓度处理设置4个重复，每个重复取150 μL供试药剂加入96孔板中，而后加入混合均匀的线虫悬液50 μL/孔。最终灵菌红素的浓度梯度为150.0、75.0、37.5、19.0、9.5 mg/L，硫酸铜的浓度梯度为150.0、75.0、37.5、19.0、9.5 mg/L，处理0、8、16、24、32 h时进行镜检，计算死亡率。

1.2.4 离体虫卵孵化率测定 用DMSO作助溶剂（终浓度应小于1%），以无菌水为溶剂配制最高浓度为300 mg/L的灵菌红素溶液，并按梯度稀释得到5个浓度的药剂，分别为300.0、150.0、75.0、37.5、19.0 mg/L。以1% DMSO水溶液为对照组（CK）。每个浓度处理设置4个重复，每个重复取150 μL供试药剂加入96孔的孔板中。而后加入混合均匀的线虫卵悬液150 μL/孔，最终灵菌红素的浓度梯度为 150.0、75.0、37.5、19.0、9.5 mg/L。处理24 h后，检测每组线虫卵的孵化率。endprint

1.2.5 数据分析 应用SPSS软件得出各处理与对照的差异显著性，利用Excel软件分析得出供试药剂的毒力回归方程式、致死中濃度LC50值及LC90值，利用Origin 8.0软件处理得到各处理的柱形图；用SPSS 22.0软件，通过单因素方差分析LSD检验来分析数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 灵菌红素的物理和化学分析

蒸发浓缩的灵菌红素溶解于甲醇中，分别用HCl、NaOH调整pH值为3、10，在300～800 nm波长范围内进行全波段扫描。pH值为3时，所得灵菌红素溶液在535 nm左右有最大吸收峰，溶液为鲜红色；pH值为10时，所得灵菌红素在466 nm左右有最大吸收峰，溶液为橘黄色（图1），与已报道的灵菌红素的吸收光谱[14]一致。

2.2 离体杀虫活性测定

浓度为150.0 mg/L的灵菌红素在处理8 h后，线虫的存活率仅为20.7%，处理24 h后，线虫存活率为0（图2-A），用同样浓度的硫酸铜处理8 h后，线虫存活率为24.0%，处理24 h后，存活率降低为0（图2-B）；当浓度降为 75.0 mg/L 时，处理8 h后灵菌红素组和硫酸铜组线虫的存活率差异并不显著，分别为22.5%、29.5%，处理24 h后，灵菌红素组的存活率降为13.2%，而硫酸铜组则迅速降为0。随着浓度继续降低，浓度为37.5、19.0 mg/L的灵菌红素的杀虫活性明显低于相同浓度的硫酸铜，处理32 h后，灵菌红素组线虫存活率为50.8%、52.5%，而硫酸铜组的为3.7%、37.1%。当二者浓度继续下降到9.5 mg/L时，处理32 h后灵菌红素组的线虫存活率为83.9%，硫酸铜组的存活率为79.0%，对照组的存活率为91.3%（图2）。可以初步得出，灵菌红素在较高浓度时的杀虫活性较同浓度的硫酸铜仍有优势，当处于较低浓度时，杀虫能力有限。尽管硫酸铜的杀虫活性较强，但其作为一种重金属盐，对环境的危害较大。当进入土壤中，会对微生物的复合生态产生不可逆的影响[14]。进入水体后，会产生更严重影响，水中的鱼类会对Cu2+进行富集，进而通过食物链进入人体，使人体产生重金属中毒现象[15]。而灵菌红素作为一种微生物的次生代谢物，即使在较高浓度时，对生态环境中的微生物区系和植物区系都不会产生不利影响[16]。并且灵菌红素具有光解特性，较高浓度的灵菌红素在产生效用之后，被逐渐稀释，而低浓度的灵菌红素在正常光照度下会被缓慢光解，进一步减少二次污染的可能性[17]。由此可见，灵菌红素可作为一种环境友好型的绿色药剂替代硫酸铜以及其他一些包括有机磷农药在内的对环境有害的药剂来防治松材线虫，其应用前景十分广阔。

2.3 灵菌红素和硫酸铜的毒性比较

通过软件得到毒力回归方程，计算不同时间点对应的半致死量（LC50）以及90%致死量（LC90），结果见表1。处理8 h后，灵菌红素的LC50、LC90分别为（58.02±4.39）、（228.31±67.48） mg/L；硫酸铜的LC50、LC90分别为（58.80±4.87）、（391.84±67.77） mg/L，灵菌红素的杀虫活性略优于硫酸铜。但处理32 h后，灵菌红素的LC50、LC90分别为（42.50±1.95）、（90.24±1.41） mg/L；硫酸铜的LC50、LC90分别为（34.58±1.37）、（60.60±1.48） mg/L，硫酸铜的杀虫活性稍强于灵菌红素。

2.4 离体虫卵孵化率测定

由图3可见，对线虫卵用无菌水和不同浓度的灵菌红素处理24 h后，清水组的孵化率为97.6%（48 h后少数卵仍未孵化，可视为正常死亡的卵），最低浓度的灵菌红素（9.5 mg/L）处理24 h后，卵的孵化率仅为45.5%。可见，灵菌红素在较低浓度时对卵的孵化率也能产生较大影响。随着灵菌红素浓度的上升，卵的孵化率进一步下降，当浓度上升至150.0 mg/L时，卵的孵化率仅为6.0%，并且孵化的虫卵在孵化后的短时间内迅速死亡。可见， 灵菌红素对卵和二龄线虫的抑制作用更强。

3 结论与讨论

黏质沙雷氏菌被报道对部分线虫具有良好的抑制作用，通过与线虫形成共生体，进而使线虫死亡，如崇明拟异小杆线虫（Heterorhabditidoides chongmingensis）[18]。但将黏质沙雷氏菌作为生防细菌直接投入到环境中对人和动物存在较大的安全隐患[19-20]。一些报道发现，有些线虫能够识别黏质沙雷氏菌，并产生防御机制，使菌体难以进入虫体寄生，如秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）[21]。所以，利用黏质沙雷氏菌的次生代谢产物灵菌红素来代替菌体细胞，能够更高效且更安全的对线虫进行防治。国内外对灵菌红素的研究主要在医药方面，但近些年发现，灵菌红素在抗线虫方面也具有较好的防治效果，主要研究的线虫种类为根结线虫、香蕉穿孔线虫等[11，22]。在防治松材线虫方面的研究仍为空白，松材线虫由于其特殊的生理结构和独特的生存环境，常规方法很难杀灭[23-24]。本试验使用的杀虫物质灵菌红素为黏质沙雷氏菌的次生代谢产物，结果显示，当灵菌红素浓度为150.0 mg/L时，24 h内能将松材线虫全部杀灭，浓度为75.0 mg/L时，在处理32 h后对松材线虫的致死率也能达到95%以上。以处理24 h的半致死量来看，灵菌红素LC50为46.97 mg/L，相比较目前使用较广泛的杀线虫有机磷农药，如克百威（LC50=488.47 mg/L）、灭线灵（LC50=51.50 mg/L），无论在作用效果还是对环境的保护上，都具有更大的优势[25]。经过多次重复试验验证，灵菌红素的杀虫活性稳定，对不同虫龄的松材线虫都具有较好的抑制作用。如果能将其投入到农林业保护的实际应用中，势必将对世界森林松材线虫的防治产生重大影响。但目前而言，灵菌红素的产量难以达到农业生产应用的水平，并且灵菌红素的光解特性使其难以成为一种持效性的杀虫药剂。接下来，笔者将对灵菌红素的发酵工艺进行优化，药物制剂的最优配比以及安全性评价作更进一步的探究。endprint

灵菌红素和硫酸铜杀虫活性比较试验显示，相同浓度的灵菌红素与硫酸铜的杀虫活性无明显差异，而硫酸铜作为一种常用的杀虫剂，对环境的污染太大，所以灵菌红素可作为一种有效的、绿色的新型农药制剂取代硫酸铜等对环境污染较大的农药。灵菌红素作为黏质沙雷氏菌等多种菌的次生代谢物，来源广泛，可通过发酵大量获取。

参考文献：

[1]Wingfield M J，Blanchette R A，Nicholls T H，et al. Association of pine wood nematode with stressed trees in minnesota，iowa，and wisconsin[Bursaphelenchus xylophilus，Dothistroma pini，Dioryctria zimmermani，Pinus spp.，insect vectors][J]. Plant Diseases，1982，66：934-937.

[2]Chitwood D J. Research on plant-parasitic nematode biology conducted by the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service[J]. Pest Management Science，2003，59（6/7）：748-753.

[3]Zhao B G. Bacteria carried by the pine wood nematode and their symbiotic relationship with the nematode[J]. Pine Wilt Disease，2008，1：264-273.

[4]Daub M. Investigations on pathogenicity，invasion biology and population dynamics of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus（Steiner und Buhrer 1934） Nickle 1970 in European conifers[M]. Berlin：Dissertationen Aus Dem JKI，2011：1-10.

[5]安玉兴，徐汉虹，黄继光，等. 16%虫线清乳油对松木中松材线虫的灭杀活性[J]. 农药，2009，48（8）：614-616.

[6]Melvin M S，Tomlinson J T，Saluta G R，et al. Double-strand DNA cleavage by copper prodigiosin[J]. Journal of the American Chemical Society，2000，122（26）：6333-6334.

[7]Gulani C，Bhattacharya S，Das A. Assessment of process parameters influencing the enhanced production of prodigiosin from Serratia marcescens and evaluation of its antimicrobial，antioxidant and dyeing potentials[J]. Malays J Microbiol，2012，8（2）：116-122.

[8]Genes C，Baquero E，Echeverri F，et al. Mitochondrial dysfunction in trypanosoma cruzi：the role of Serratia marcescens prodigiosin in the alternative treatment of chagas disease[J]. Parasit Vectors，2011，4（8）：263-272.

[9]Tomás R P，Ruir C D，Montaner B. Prodigiosin induces cell death and morphological changes indicative of apoptosis in gastric cancer cell line hgt-1[J]. Histology and Histopathology，2001，16（2）：415-421.

[10]Patil C D，Patil S V，Salunke B K，et al. Prodigiosin produced by Serratia marcescens nmcc46 as a mosquito larvicidal agent against Aedes aegypti and Anopheles stephensi[J]. Parasitology Research，2011，109（4）：1179-1187.

[11]Rahul S，Chandrashekhar P，Hemant B，et al. Nematicidal activity of microbial pigment from Serratia marcescens[J]. Natural Product Research，2014，28（17）：1399-1404.

[12]賁爱玲，韩正敏，韩 旭，等. 无菌松材线虫的获得及培养方法研究[J]. 南京林业大学学报（自然科学版），2008，32（3）：99-102.

[13]Viglierchio D R，Schmitt R V. On the methodology of nematode extraction from field samples：comparison of methods for soil extraction[J]. Journal of Nematology，1983，15（15）：450-444.endprint

[14]Wasserman H H，McKeon J E，Smith L A，et al. Studies on prodigiosin and the bipyrrole precursor[J]. Tetrahedron，1966，22（S8）：647-662.

[15]张倩茹，周启星，张惠文. 乙草胺与硫酸铜对黑土微生物的复合生态影响[J]. 环境科学，2007，28（4）：826-831.

[16]缪 柳，洪俊明，林 冰. 络合硫酸铜除藻剂应急治理水华对水质及鱼类的影响[J]. 生态与农村环境学报，2011，27（5）：63-66.

[17]刘伯雅，魏东芝，鲁思然，等. 灵菌红素对有害藻类的除藻活性研究[J]. 中国环境科学，2010，30（4）：477-482.

[18]Zhang C X，Liu J R，Xu M X，et al. Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov.，sp. nov.（Rhabditida：Rhabditidae），a novel member of the entomopathogenic nematodes[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2008，98（2）：153-168.

[19]Jeong H U，Mun H Y，Oh H K，et al. Evaluation of insecticidal activity of a bacterial strain，Serratia sp. eml-se1 against diamondback moth[J]. The Journal of Microbiology，2010，48（4）：541-545.

[20]Yao C A，Wang D，Kulber D A. The story of Serratia marcescens：pathologic risk factors in breast implant surgery[J]. Archives of Plastic Surgery，2014，41（4）：414-417.

[21]Pradel E，Zhang Y，Pujol N，et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by caenorhabditis elegans[J]. Proceedings of The National Academy of Sciences，2007，104（7）：2295-2300.

[22]Mohamed Z K，El-Sayed S A，Radwan T E E，et al. Potency evaluation of Serratia marcescens and Pseudomonas fluorescens as biocontrol agents for root-knot nematodes in egypt[J]. Journal of Applied Sciences Research，2009，4：93-102.

[23]蒙春蕾，王勇勇，黃 敏，等. 不同氮源对海洋真菌BH0531发酵液杀线虫活性的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（5）：121-123.

[24]吴 晶，蔡正清，许忠祥，等. 热处理松材线虫在实际生存环境中的致死温度[J]. 江苏农业科学，2015，43（7）：123-125.

[25]洪 森，王新荣，徐汉虹. 嘧啶氧磷对松材线虫的有效杀线活性[J]. 广东林业科技，2014，30（1）：26-30. 李 安，田昌义，许 沛，等. 响应曲面法优化雷公藤农药用总生物碱的闪式双水相提取工艺[J]. 江苏农业科学，2017，45（19）：187-190.endprint