姚雪莲+陈查丹+张晶+崔汉峰+林艳+洪年+何玲玲+孔德荣+樊浩+程林

摘 要 基于β环糊精（βCD）主客体竞争模式，构建了开关型凝血酶适配体电化学传感器。将末端修饰了二茂铁（Fc）的核酸适配体通过与βCD的主客体识别固定在金电极表面，当凝血酶存在时，适配体由原来的直立线状构型变为“G四链体”，远离电极表面，适配体探针的氧化还原电流强度减小，即“Signaloff”。利用此效应对凝血酶进行了灵敏检测，结果表明，在5.0×10mol/L（3σ）。与其它蛋白分子相比，本方法对凝血酶蛋白的检测具有高特异性。本传感器构建简单，再生性好，为生物血清样本中凝血酶的实时高效检测提供了方法。

1 引 言

凝血酶是一种重要的凝血系统丝氨酸蛋白酶，在伤口愈合、血管止血、炎症、组织黏合、动脉硬化等过程中发挥了重要作用[1，2]。此外，凝血酶对肿瘤细胞的生长具有调节作用，浓度较低时促进生长，浓度较高时抑制其生长，甚至产生凋亡效应[3]，在激活正常细胞的致瘤性和恶性细胞转移方面也扮演着重要角色[4，5]。凝血酶含量是衡量机体凝血功能异常一种指标，因此，建立灵敏、快速检测凝血酶的方法对疾病诊断具有重要意义。

适配体（Aptamer）可与目标物高特异性、高选择性结合，具有易合成、易修饰、高稳定性、配体广泛、无免疫原性、易储存等优点[6]，基于适配体的传感方法近年来得到广泛应用[7～12]。很多文献报道了利用适配体构建的凝血酶电化学传感器 [13～19]。Gao[20]等设计了一种三明治型凝血酶适配体电化学传感器，将巯基化的一条适配体固定在金电极表面，形成适配体凝血酶复合物，并与另一条修饰了Pt NPs/CNCs的适配体结合，通过纳米粒子催化H2O2的电化学还原产生阴极电流，对凝血酶实现放大检测，检出限为1.0×10

mol/L。Wang等[21]基于金纳米粒修饰的au@GS和CoPd NPs，用巯基标记的探针作为捕获探针，生物素标记的探针作为报道探针，形成的夹层结构对凝血酶的检出限低至5 pg/mL。这些方法虽然能有效放大信号，但是檢测过程中需多步识别，操作过程复杂。有研究者利用电活性标记物在电极表面的电子传递构建了“Signalon”开关型凝血酶电化学传感器，如Radi[22]和Katakis[23]等将Fc标记的适配体通过巯基固定在金电极表面，适配体与凝血酶结合后，形成刚性的“G四链体”结构而靠近电极表面，电化学信号增大，从而实现对凝血酶的检测。Xiao等[24]设计了同样检测原理的凝血酶传感器，利用适配体凝血酶的特异性结合，使适配体上标记的亚甲基蓝（MB）与电极表面接近，使信号增强， 2.56×10mol/L的凝血酶响应信号约为空白的270%。此类传感器是通过与凝血酶识别前后标记物与电极表面距离发生的改变而导致电信号的改变进行测定，虽然构建简便，但电化学标识物的电子传递受到了适配体链长度的限制，因而对灵敏度有所影响。

环糊精是直链淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶作用下所生成的系列环状低聚糖的总称，通常含6～12个D吡喃葡萄糖单元，其中βCD是研究较多的含有7个葡萄糖单元的分子。环糊精分子具有类似锥形的中空圆筒腔体结构，内部是疏水空腔而外部是亲水环形。其特殊的腔体结构使得环糊精具有突出的识别和包络客体分子的能力，如有机分子、无机离子等，这种主客体间的识别作用能使分子形成良好组装体系，在医药、分析、化工、环保等研究领域受到广泛关注[25]。本研究利用βCD与Fc的主客体识别原理，构建了一种“Signaloff”的开关型适配体传感器，用于凝血酶的检测。3′标记Fc的抗凝血酶适配体利用βCD与Fc客体的识别作用组装到修饰βCD的电极表面（实验原理见图1），在凝血酶不存在时，由于Fc在电极表面发生氧化还原给出电化学响应信号； 凝血酶存在时，与适配体特异性结合，适配体构型发生改变，离开电极表面，电子传递受阻，信号减弱。本方法中，适配体与凝血酶结合后标记物直接脱离电极表面，检测信号不受适配体链长度的影响，因此灵敏度高。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

AUTOLAB电化学工作站（瑞士万通仪器有限公司）； 采用三电极体系：金电极（直径1.0 mm）为工作电极，Ag/AgCl电极（饱和KCl）为参比电极，铂电极为对电极； 400 MHz核磁共振波谱仪（瑞士Bruker科技有限公司）。

βCD（SigmaAldrich公司）； 凝血酶、牛血清白蛋白（BSA）、溶血酶（生工生物工程（上海）股份有限公司）； 核酸适配体序列：3′FcGGTTGGTGTGGTTGG5′（大连宝生物工程有限公司）； 所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水（美国Millipore公司超纯水系统）制备。

2.2 SHβCD的合成

参照文献[26]，将βCD （1.10 g， 1.0 mmoL）加入含三苯基膦（5.20 g， 20 mmoL）和碘（5.05 g， 20 mmoL）的20 mL 二甲基甲酰胺（DMF）中，混合体系在氮气保护下80℃磁力搅拌15 h，将反应液浓缩约1/2，使得pH=9.0～10.0，再加入甲醇钠的甲醇溶液 （3 moL， 8.0 mL）中，冷却后在室温下放置30 min，以破坏在反应中形成的酯类，加入100 mL冰甲醇和500 mL冰水环境下产生沉淀，收集沉淀，用冰水和甲醇冲洗，干燥后得到白色粉末（6IβCD）（1.56 g，82%）。

取6IβCD（1.56 g， 0.82 mmoL）、硫脲（0.48 g， 6.4 mmoL） 溶于16 mL DMF中，氮气保护下70℃反应19 h后，减压除去DMF，再加入NaOH（0.42 g， 1.05 mmol/L），氮气氛下加热回流1 h后，用水合KHSO4过滤沉淀，用蒸馏水洗涤，干燥除去残留的DMF。在得到的悬浮液中加入少量NaOH使澄清，加入KHSO4产生沉淀，经过滤真空干燥后得到白色粉末（0.85 g，83%），即6SHβCD，所得1H NMR化学位移为：δ 5.92（d， J=6.0 Hz， 7 H）， 5.82（s， 7 H）， 4.93（s， 7 H）， 3.68（t， J=6 Hz， 7 H）， 361（t， J=7.5 Hz， 7 H）， 3.19（brd， J=15 Hz， 7 H）， 2.77～2.74（m， 7 H）， 2.13（t， J=6.0 Hz， 7 H）， 如图2。endprint

2.3 传感器的制备

分别用0.30和0.05 μm Al2O3粉末打磨金电极，用超纯水超声清洗后在0.5 mmoL/L H2SO4中进行循环伏安扫描（扫描电压

0.01 mol/L SHβCD溶液中，4℃孵育2 h。修饰后的电极用20 mmol/L TrisHCl缓冲液（pH 7.4）清洗，氮气流下干燥，再将电极浸泡在3.0×10

mol/L适配体乙醇（1∶1，V/V）的溶液中12 h，将适配体组装到电极表面，用超纯水清洗后于氮气流下干燥，即制得传感器。

2.4 凝血酶的检测

在TrisHCl缓冲液中，将制备的适配体传感器用示差脉冲伏安法（DPV）进行电位扫描（扫描范围0.2～0.6 V，增量0.001 V，脉冲振幅0.05 V，扫描速率0.002 V/s），记录峰电流的大小。然后在缓冲液中加入凝血酶，37℃下孵化5 min后，测量DPV峰电流大小，加入凝血酶前后峰电流变化的差值可用于定量检测凝血酶。

3 结果与讨论

3.1 主客体识别的验证

为了研究βCD的主客体识别特性，分别将裸金电极和SHβCD修饰的金电极浸泡在浓度为1.0×10

mol/L Fc溶液中10 min后，在TrisHCL缓冲液中进行DPV扫描。结果表明，裸电极在0.2 V附近未观察到Fc的氧化还原峰（图3 曲线a），说明Fc未吸附在电极表面； 修饰了SHβCD的金电极则在1.1 μA处产生了明显的氧化还原峰（图3 曲线b），证明基于βCD和Fc的主客体识别作用使大量的Fc

固定于金电极表面。

3.2 修饰电极的电化学阻抗表征

采用电化学阻抗对电极的组装和监测过程进行了表征，如图4所

示，裸金电极作为一个理想的导体在阻抗谱

中的高频部分出现一个小半圆（曲线a），其直径相当于电子转移阻抗（Ret）； 用SHβCD修饰电极后，金电

在金电极表面的电子交换，Ret值从裸电极的345 Ω增加到990 Ω（曲线b）； 将适配体组装到电极表面后，电极表面与氧化还原探针间的负电荷相互排斥，阻碍了电子传递，使得Ret值继续增大至1300 Ω（曲线c），表明适配体组装成功； 与5.0×mol/L凝血酶作用后，适配体的构型发生改变离开电极，少数未反应部分仍留在电极表面，因而电极的Ret阻抗值减小为1140 Ω（曲线d）。

3.3 传感器的分析性能

将制备的适配体传感器分别与0、5.0×10mol/L的凝血酶作用，发现随着凝血酶浓度的增加，DPV信号强度从1.0 μA降至0.1 μA（如图5 a～f）这是因为不同浓度的凝血酶与适配体结合后构型改变，Fc标记物远离电极表面，电子传递阻碍越来越大，表现为电流信号减弱。对响应信号进行线性回归，在5.0×10 mol/L范围内，凝血酶浓度与信号响应值呈负相关（图5插图），线性回归方程为y=-0.1577lgx-1.1885， 相关系数r=0.9949， 检出限为2.0×10

3.4 传感器的特异性

考察了传感器对其它蛋白分子的响应，用传感器分别检测TrisHCl缓冲液、5.0×10mol/L BSA、5.0×10mol/L 溶血酶、5.0×10mol/L凝血酶，如图6中a～d，结果表明，只有凝血酶的一组的信号明显减小。在5.0×10mol/L凝血酶中分别混合了10和100倍于凝血酶浓度的BSA、溶血酶、BSA和溶血酶，发现并未干扰凝血酶的测定，检测到的信号峰无明显变化（图6中e～j），表明此传感器对凝血酶的检测不受其它共存蛋白分子的影响，可实现凝血酶的特异性检测。

3.5 实际血清样本分析

为了研究此传感器的实际应用性能，用江西中医药大学附属医院健康志愿者血清样本（江西中医药大学附属医院）进行了加标回收实验。将5 μL血清样本用TrisHCl缓冲液稀释10倍后，再分别加入不同浓度的凝血酶，实验结果见表1，回收率为95.5%～104.1%，RSD为4.8%～8.0%，可满足对实际样本的高效检测的要求。

mol/L凝血酶进行再次检测， 发现DPV信号与再生之前基本一致，如图7所示，在连续再生6次后的电极响应基本不变。构建的分子识别型传感器与目标物结合后，Fc随着适配体离开电极表面，再次使用时，识别过程不受影响，表现出良好的再生性。

4 结 论

本研究构建的基于主客体竞争模式的适配体传感器成功实现了对凝血酶的高效检测，适体探针与目标物凝血酶结合后，脱离电极，使得信号变化最大化，克服了以往这類传感器灵敏度受限制的缺点。同时，相比于通过金硫键固定适体构建的传感器，使用主客体识别修饰电极，更容易使传感器再生。 此传感器制备简单，操作简endprint