丁泽红+付莉莉+黄猛+颜彦+铁韦韦+张家明+胡伟

摘要：对从木薯Ku50叶片中克隆的1个P5CS基因MeP5CS1进行聚乙二醇（PEG）、脱落酸（ABA）、盐胁迫下的表达分析，结果表明，基因MeP5CS1具有1个2 220 bp的开放阅读框，编码739个氨基酸，且含有P5CS保守结构域；MeP5CS1与杨树、杞柳的P5CS基因亲缘关系相对较近，序列相似性分别达到88.61%、88.95%；MeP5CS1基因在第1张完全展开叶、老叶中的表达量受到PEG处理诱导，且与叶片中脯氨酸的含量变化趋势一致；MeP5CS1基因的表达还受到脱落酸（ABA）、盐胁迫处理的诱导。在此基础上，成功构建MeP5CS1基因的植物表达载体pCAMBIA 2300-MeP5CS1，为进一步解析MeP5CS1在木薯抗旱中的作用机制提供参考。

关键词：木薯；MeP5CS1；非生物胁迫；克隆；基因表达；载体构建

中图分类号： S533.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0040-03

收稿日期：2016-05-09

基金项目：海南省自然科学基金（编号：20163120、20153048）。

作者简介：丁泽红（1982—），男，湖南岳阳人，博士，助理研究员，主要从事植物分子生物学研究。E-mail：dingzehong@itbb.org.cn。

通信作者：胡 伟，博士，副研究员，主要从事植物分子生物学研究。Tel：（0898）66989380；E-mail：huwei2010916@126.com。 干旱是世界农业面临的最严重问题之一。随着全球发生周期性降水分布不均、水资源受到污染等现象，植物面临干旱胁迫的程度日益加剧，不但导致农作物产量严重减少，而且还使得旱地面积持续扩大，制约着农业的可持续发展[1]。在漫长的环境适应和驯化过程中，植物形成了多种生理生化策略以应对干旱胁迫，如当植物遭受长时间和较为严重的干旱时，植物冠层的光合作用将显著减少；为尽快适应缺水的情况，植物通过老叶的脱落来减少水分消耗，或增加根长来吸收更深层的地下水[2]，脯氨酸等各种小分子化合物将被合成并迅速积累以保持细胞中的含水量[3]等等。

脯氨酸是植物面对水分、高盐等逆境胁迫最为重要的渗透调节物质，提高植物中脯氨酸的积累对提升植物抗渗透胁迫能力具有重要的意义。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是植物脯氨酸生物合成途径中的关键酶，决定着植物体内脯氨酸的积累速度[4]。目前，对很多植物中的P5CS基因研究较为深入[5-7]，并发现P5CS转基因植株的抗逆性表型增强[8-9]。木薯是重要的粮食作物和经济作物，虽具有一定的抗旱特性，但同大多数作物一样，干旱胁迫仍严重地影响木薯的生长和发育，导致木薯块根产量减少[2]，而与模式植物相比，木薯的重要经济性状基础理论研究还相对薄弱，与抗旱相关的分子机制尚不明确。本研究在克隆木薯P5CS基因MeP5CS1的基础上，分析MeP5CS1基因在聚乙二醇（PEG）、脱落酸（ABA）和盐胁迫条件下的表达量变化，并构建相关的植物表达载体，为进一步解析木薯的抗旱机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料的准备

试验材料为木薯栽培品种Ku50，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供，在木薯种植季节，将Ku50种茎切成长度约15 cm的茎段，挑选含3～4个芽眼/茎段、粗细均匀一致的茎段，扦插于高为18.8 cm，上、下直径分别为18.5、14.8 cm的塑料盆中，1茎段/盆。基质采用营养土与蛭石以 1 ∶ 1 的体积比进行混合。木薯种植约10 d进行间苗，保留1苗/盆。

1.2 试验处理

木薯盆栽种植60 d，选取长势一致的植株用20% PEG6000溶液模拟干旱胁迫，以浇灌自来水为对照，分别在处理0、3、6、12、24 h时，按照Bates等的方法[10]测定叶片脯氨酸含量，同时，分别在处理0、3、24 h时采集未展开叶、第1张完全展开叶、老叶、根。此外，对种植60 d的木薯幼苗用100 μmol/L ABA喷施，在处理0、2、6、10、24、48、72 h时采集未展开叶、第1张完全展开叶、老叶；另用200 mmol/L NaCl进行灌根，在处理0、2、6 h及3、14、18、24 d同样采集叶片。根、叶样品液氮冷冻、-80 ℃保存，待测。

1.3 RNA提取与cDNA合成

按照天根生化科技有限公司生产的RNA提取试剂盒说明书提取木薯的总RNA；利用Fermentas公司生产的第一链cDNA合成试剂盒（revert aid first strand cDNA synthesis kit）将总RNA反转录成cDNA，-20 ℃储存，备用。

1.4 引物设计与实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）

用Primer 6.0设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。MeP5CS1基因全长扩增正向、反向引物分别为L1：5′-GGGGTACCCTGCTCATGGCTGCAAACTG-3′、R1：5′ -GCGTCGACATGAAGCAACGGTGGGAGAT-3′（下划线为酶切位点），分別带有KpnⅠ和SalⅠ酶切位点及保护碱基，可用于植物表达载体的构建。qRT-PCR引物包括MeP5CS1基因特异性引物L2：5′-GCTTATGCTGGTGTCC CTGT-3′、R2：5′-CACGCGCACCAAAGTGTTTA-3′及actin基因引物L3：5′-GATGAGTCTGGTCCATCCA-3′、R3：5′-CTCCTACGACCCAATCTCA-3′[11]。qRT-PCR采用TaKaRa公司生产的R GreenⅠ试剂盒，按照说明在Stratagene公司生产的3005P荧光定量PCR仪上进行操作，反应程序为95 ℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40个循环。每个样品重复3次，表达量按照ΔΔCT法进行计算[12]。endprint

1.5 生物信息学分析

采用Clustal X软件对序列进行比对；采用CDD数据库 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）预测保守结构域；采用ORF Finder、GenScan软件预测开放阅读框；采用ExPASy ProtParam软件分析蛋白质的分子量和等电点；采用Mega 5.2軟件构建进化树。

1.6 植物表达载体的构建

用限制性内切酶KpnⅠ、SalⅠ分别对含有目的基因MeP5CS1的重组质粒和植物表达载体pCAMBIA2300进行双酶切。酶切体系20.0 μL：d2H2O 7.0 μL，质粒10.0 μL，10 × FastDigest Buffer 2.0 μL，KpnⅠ和SalⅠ各0.5 μL，37 ℃反应4 h。反应产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，分别回收MeP5CS1目的片段和pCAMBIA 2300载体片段；用T4连接酶将目的基因片段和植物表达载体片段进行连接，16 ℃过夜反应；将连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选阳性克隆；进行PCR及双酶切验证，测序，构建植物表达载体pCAMBIA 2300-MeP5CS1。

2 结果与分析

2.1 基因MeP5CS1的克隆

以木薯Ku50叶片cDNA为模板，用基因特异性引物进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得1条2 600 bp左右的单一条带。回收PCR产物连接pMD19-T simple载体，测序得到1条2 627 bp的序列，包括343 bp的5′非翻译区（5′UTR）、2 220 bp的开放阅读框、64 bp的非翻译区3′ 非翻译区（3′ UTR），该序列编码739个氨基酸。Blast结果表明，MeP5CS1与木薯数据库中公布的P5CS基因（Manes.10G024800.1）只有4个碱基的差异，同源性高达99%。与基因组信息比对发现，MeP5CS1基因含有20个外显子。预测的蛋白质分子量为 80 139.4 ku，理论等电点（pI）为6.18。蛋白质结构域预测显示（图1），MeP5CS1编码的蛋白含有P5CS保守结构域PLN02418，这进一步表明克隆到的基因为P5CS基因。

2.2 基因MeP5CS1进化树分析

经序列比对，获得与MeP5CS1同源性较高的其他物种序列，由图2可见，P5CS基因大致可聚为3类；第Ⅰ类以C4物种为代表，包括谷子、狗尾草、柳枝稷、玉米和高粱；第Ⅱ类包括拟南芥、荠菜花和白菜型油菜；木薯MeP5CS1被聚类到第Ⅲ类，与杨树、杞柳的亲缘关系相对较近，序列相似性分别达到88.61%、88.95%。

2.3 脯氨酸含量与MeP5CS1表达分析

2.3.1 PEG胁迫对木薯叶片脯氨酸含量的影响 用20% PEG6000溶液模拟干旱胁迫，测定PEG处理对木薯叶片中脯氨酸含量的影响。由图3可见，对照处理（浇灌自来水）的木薯叶片脯氨酸含量相对比较稳定，维持在22 μg/g左右；随处理时间的延长，PEG处理的木薯叶片脯氨酸含量迅速累积，呈线性增长趋势，24 h达到最大值。

2.3.2 PEG胁迫处理对基因MeP5CS1表达量的影响 由图4可见，处理0 h时，MeP5CS1在未展开叶、根中的表达量相对比较接近，明显高于在第1张完全展开叶、老叶中的表达量；与0 h相比，处理3 h时各组织中的MeP5CS1表达量基本没有变化， 处理24 h时， MeP5CS1在第1张完全展开叶中的表达量增加约2倍， 老叶中增加约5倍， 未展开叶、根中的变

化仍然不大，这说明MeP5CS1主要在第1张完全展开叶和老叶中发挥功能。

2.3.3 ABA、 NaCl处理对基因MeP5CS1表达量的影响 由

图5、图6可见，ABA处理2～6 h，叶片中MeP5CS1的表达量有明显上升；与对照（处理0 h）相比，ABA处理10 h的MeP5CS1表达量没有明显变化，但在处理24～72 h时，叶片中MeP5CS1的表达量维持在明显诱导水平；NaCl处理3、24 d时，叶片中MeP5CS1表达量被明显诱导，其他处理时间点与对照相比没有太大变化。因此，ABA、NaCl处理能够明显诱导MeP5CS1的表达。

2.4 木薯MeP5CS1表达载体的构建

用限制性内切酶KpnⅠ、SalⅠ分别对含有目的基因MeP5CS1的重组质粒和植物表达载体pCAMBIA 2300进行双酶切，连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒经PCR检测，电泳获得1条约2 600 bp的条带；同时，提取质粒进行双酶切反应，分别获得约9 500 bp的载体和约2 600 bp的条带（图7），2种验证方法都获得与目的基因片段大小一致的条带。经进一步测序验证，明确为MeP5CS1基因，这表明已成功构建pCAMBIA 2300-MeP5CS1植物表达载体。

3 结论与讨论

P5CS是植物细胞脯氨酸生物合成途径的关键酶，目前，

已经从许多植物中分离得到，并从分子角度证明该基因是一个重要的植物抗逆相关基因[6-9]，而木薯中有关P5CS基因的研究相对很少。本研究从木薯Ku50中克隆了MeP5CS1基因，该基因具有1个2 220 bp的开放阅读框，编码739个氨基酸，与其他物种中的P5CS大小基本一致[7-9]，序列分析表明，MeP5CS1与杨树、杞柳中P5CS基因的亲缘关系相对较近。

脯氨酸是植物细胞中重要的渗透调节物质，在干旱、高盐等逆境胁迫条件下，脯氨酸含量会迅速积累以减轻胁迫伤害[8]。P5CS作为脯氨酸合成途径的限速酶，其表达量也相应地被快速诱导，且具有不同的组织表达特异性[13]。木薯作为一种典型的抗旱作物，有关其P5CS基因对非生物逆境胁迫的响应尚不清楚。本研究发现，PEG6000胁迫处理能诱导木薯叶片中脯氨酸含量快速积累，PEG胁迫处理24 h，MeP5CS1在第1张完全展开叶和老叶中的表达量增加2～5倍，与脯氨酸含量的变化相对一致，暗示MeP5CS1主要负责胁迫木薯第1张完全展开叶、老叶中脯氨酸的积累；正常条件下，MeP5CS1倾向于在幼嫩的组织和根中的表达，与周精华等研究结论[14]相对一致。此外，MeP5CS1表达还受到ABA、盐胁迫处理的诱导。endprint

构建表达载体是基因功能验证的主要手段之一。张霞等将2个水稻P5CS基因在烟草中进行过表达，转基因植株脯氨酸含量有显著增加[9]；Ehsanpour等研究也表明，干旱条件下P5CS转基因在烟草叶片、根中的脯氨酸含量有显著增加[15]。本研究成功构建了木薯MeP5CS1基因表达载体pCAMBIA 2300-MeP5CS1，为进一步研究该基因在木薯干旱等非生物胁迫中的功能奠定了基础。

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