乔木　程碧军　武华玉

摘要：旨在研究反转录转座子1基因（retrotransposon-like-1，RTL1）潜在的变异与猪胴体和肉质性状的相关性。测序发现在猪RTL1基因编码区1 209 bp处存在G/A突变，利用PCR-Fnu4H I-RFLP方法在9个猪种中进行了基因分型，并且在360头大白猪×梅山猪F2代群体中进行性状关联分析。结果表明，该位点与皮率、内脂率、6-7腰椎间膘厚、胸腰椎间膘厚、背最长肌pH、股二头肌肌肉色值呈显著相关（P<0.05），与骨率、肩部膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚、背最长肌失水率、背最长肌系水力、背最长肌肌肉色值呈极显著相关（P<0.01）。

關键词：猪；RTL1基因；单核苷酸多态性；性状关联分析

中图分类号：S828.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）20-3948-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.20.038

Abstract： This study was conducted to investigate the potential association of variation in the retrotransposon-like-1 （RTL1） gene with carcass and meat quality traits in pigs. Cloning and sequencing found that there was a G/A mutation at 1 209 bp in the porcine RLT1 gene coding region. Using PCR-RFLP， SNP of RTL1 gene was detected in nine different pig breeds and performed associations with carcass and meat quality traits in 360 Large White and Meishan F2 hybrids. The results showed this polymorphism is significant association with skin percentage，internal fat rate，6-7 rib fat thickness，thorax-waist fat thickness，Meat pH（m.longissimus Dorsi，LD） and meat color value（BF）（P<0.05），is higher significant association with bone percentage，shoulder fat thickness，buttock fat thickness，average backfat thickness，longissimus dorsi drip loss rate，longissimus dorsi water holding capacity and meat color value （LD）（P<0.01）.

Key words： pig； RTL1 gene； single nucleotide polymorphism （SNP）； association analysis

反转录转座子1基因（Retrotransposon-like-1，RTL1），又名父本表达基因11（paternally expressed gene 11，Peg11）， 在人和小鼠中为父本表达的印记基因，不含内含子序列[1，2]。RTL1基因在胚胎和胎盘组织中表达量很高，对母体胎盘与胎儿的营养传递起着重要作用，敲除该基因的小鼠表现为胎儿死亡率升高、新生儿生长停滞、胎盘尺寸偏小[3]； 与人的胎儿发育和新生儿的生长也有密切关系[4，5]。该基因位于DLK1-DIO3印记区域，该区域基因对肌肉发育和脂肪沉积有一定的影响[6，7]，在转基因小鼠中异位表达RTL1基因，会导致肌肉肥大[8]；此外，该基因与callipyge绵羊的肌肉肥大相关，双肌臀的绵羊中RTL1基因的表达量是正常绵羊中的12倍[9，10]。RTL1基因与动物的生长和肉质性状有着密切的关系。目前关于此基因在猪中的研究较少，本研究分离克隆了RTL1基因，对其遗传多态性进行了筛选，并与猪胴体和肉质性状进行关联分析，以期获得猪生产性状相关的新分子标记。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集大白猪和梅山猪（华中农业大学试验猪场）各4头血样，提取基因组DNA，用于基因克隆及多态性检测；

大白猪×梅山猪F2代群体360头（华中农业大学实验猪场），收集性状记录，用于关联分析；采集9个品种猪的DNA样品包括：大白猪、长白猪、梅山猪、皮特兰猪、杜洛克猪、阳新猪、皖南猪、鄂西黑猪和监利猪，用于基因型频率分析。

1.2 PCR扩增、测序及SNP筛选

基因组DNA的提取采用QIAGEN公司的DNA提取试剂盒（QlAamp DNA Mini Kit50），按照说明书进行提取。

根据猪RTL1基因的基因组序列（GenBank登录号：ACF47571），采用Primer 5软件设计引物。上游引物：5′-AGGGCCACCCCAGCCTCGA-3′，下游引物：5′-GGCTTCTCGAAGAGCTGGAC-3′，由北京奥科生物技术有限公司合成。PCR反应体积为20 μL：DNA 模板1 μL、2×Taq PCR Mix 10 μL、ddH2O 8 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，66.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物于1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，以3 μL DNA Marker DL 2000作为参照。电泳结束后，用凝胶成像系统观察扩增结果。将目的条带用百泰克试剂盒回收纯化，回收后的PCR产物与pMD-18T 载体连接并转化DH5α感受态细胞， 克隆子送至北京奥科生物技术有限公司测序，序列比对筛选SNP。endprint

1.3 SNP驗证

采用PCR-Fnu4H Ⅰ-RFLP方法对SNP位点进行检测。酶切体系为10 μL，其中PCR扩增产物5 μL，10×Buffer 1 μL，限制性内切酶0.5 μL（10 U/μL），ddH2O 3.5 μL，37 ℃酶切反应4 h，后经2.5%的琼脂糖凝胶电泳分析。

1.4 统计分析

采用SAS 8.0软件的GLM程序进行标记的关联分析，采用REG程序计算基因的加性效应和显性效应，所用模型[11]为Yijkl=μ+Gi+Fj+Sk+Yl（+bijklXijkl）+eijkl。Yijkl为性状表型值，μ为群体均值，Gi为基因型效应，Sk为性别效应，Yl是年份效应，Fj和Yl分别为家系和年度效应，bijk为屠宰体重的回归系数，Xijk是协变量屠宰体重，eijk为残差效应。

2 结果与分析

2.1 猪RTL1基因多态性检测结果

猪RTL1基因外显子1 209 bp处的G/A突变能够引起外切酶Fnu4H Ⅰ酶切位点的改变，当该位点为G时，可以被内切酶Fnu4H Ⅰ切为两个片段126 bp和40 bp（GG型），当该位点为A时不能被酶切，片段大小为166 bp（AA型），当G和A都存在时，有3条带，即126、40和166 bp（AG型）， 酶切分型结果见图1。

2.2 猪RTL1基因SNP位点在不同猪种中的分布规律

在9个中外猪种中进行多态性分布检测，其中5个国内猪种（梅山猪、阳新猪、皖南猪、监利猪和鄂西黑猪）和4个外来品种（大白猪、长白猪、杜洛克猪和皮特兰猪），结果如表1所示。G等位基因频率在国外猪中占优势，在国内猪种中A等位基因占优势。

2.3 关联分析

在360头大白猪×梅山猪F2代群体中分析了猪RTL1基因SNP位点基因型与胴体性状和肉质性状的相关性。如表2和表3所示，与皮率、内脂率、6-7腰椎间膘厚、胸腰椎间膘厚、背最长肌pH、股二头肌肌肉色值呈显著相关（P<0.05），与骨率、肩部膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚、背最长肌失水率、背最长肌系水力、背最长肌肌肉色值呈极显著相关（P<0.01）。

3 讨论

本研究通过PCR-Fnu4H Ⅰ-RFLP方法在360头大白猪×梅山猪F2 代群体中检测了RTL1基因外显子1 209 bp处G/A突变位点，关联分析结果显示RTL1基因与胴体性状和肉质性状呈显著相关。AA基因型个体的内脂率、肩部膘厚、6-7腰椎间膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚显著高于GG基因型，这与不同品种中基因型分布规律相吻合，国内猪种中A等位基因占优势，而国内猪种比国外猪种具有较高的肥肉率，说明A等位基因有促进脂肪沉积的效应。在肉质性状方面，AA基因型个体与比GG基因型个体相比，具有较高的背最长肌肌肉色值和股二头肌肌肉色值，较低的背最长肌pH和背最长肌系水力，说明该位点可以作为改善猪肉质性状的分子标记。

在基因效应方面，皮率、板油重、内脂率、6-7腰椎间膘厚、胸腰椎间膘厚、背最长肌pH等性状加性效应显著（P<0.05），骨率、肩部膘厚、臀部膘厚等性状加行效应极显著（P<0.01）。加性效应是可以遗传的，因此可以采用分子标记辅助选择和常规选择项结合的方法对猪皮率、板油重、内脂率等性状进行固定[12]。RTL1基因可以作为改善猪脂肪沉积和肉质性状的候选基因。

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