黄丽萍　燕波　侯敏　孙梦盛　何堃　官扬　姚丽华　周茂福

[摘要]该研究采用网络药理学的方法，将阿尔茨海默病的关键靶点与二至丸化合物进行分子对接，通过Cytoscape 321 软件，建立成分靶点、靶点信号通路网络模型进行网络分析，探讨二至丸防治阿尔茨海默病的物质基础与作用机制。模拟筛选出来的30个化合物与阿尔茨海默病关键靶点及靶点集中所在的Wnt， MAPK， PI3KAktmTOR 3条信号通路均有很强的相互作用，其中有槲皮素、香叶醇、β谷甾醇、橙花醇、圣草酚5个成分可通过文献验证，初步揭示了二至丸防治阿尔茨海默病的物质基础及其在3条信号通路上的作用机制。通过网络药理学方法发现，二至丸防治阿尔茨海默病的活性成分可能是槲皮素、香叶醇、β谷甾醇、橙花醇、圣草酚，其作用机制可能与Wnt， MAPK， PI3KAktmTOR 3条信号通路有关。

[关键词]网络药理学； 分子对接； 二至丸； 阿尔茨海默病

[Abstract]The present study is to explore the material basis and mechanism of Erzhi Wan the prevented Alzheimer′s disease by using network pharmacology The key target of Alzheimer′s disease was docked with the Erzhi Wan compounds， and the drugstarget combined with targetsignal pathway network model was established by Cytoscape 321 software Thirty compounds have a strong interaction with key target of Alzheimer′s disease and three key pathways related with Wnt， MAPK and PI3KAktmTOR There are 5 ingredients such as quercetin，geraniol，betasitosterol，nerol，eriodictyol that could be verified from literatureThis result initially revealed the material basis for Erzhi Wan for Alzheimer′s disease and the mechanism in terms of three signaling pathways The network pharmacology method found that the active ingredients of Erzhi Wan for Alzheimer′s disease may be quercetin，geraniol，betasitosterol，nerol，and eriodictyol， and the mechanism may be related to three signal pathways including Wnt， MAPK， and PI3KAktmTOR.

[Key word]network pharmacology； molecular docking； Erzhi Wan； Alzheimer′s disease

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）以进行性记忆和认知功能障碍为主要表现，其病理学特征表现为β淀粉樣蛋白（amyloid beta，Aβ）聚集形成老年斑（sennepfaques，SPs）、细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经元纤维缠结（neurofibrillarytangles，NFTs）和神经元死亡[1]。随着老龄化程度的加重，AD发病率逐年上升，严重威胁老年人的生命安全，是继心脏病、癌症后的第3位死因，给家庭和社会带来严重的经济负担[2]。现有药物能在一定程度上控制、缓解AD症状，但治疗效果不理想，因此寻找高效药物以延缓、控制AD的发生和发展具有重要的社会意义。二至丸由女贞子（蒸）、墨旱莲（1∶1）2味中药组成，其药理作用包括保肝、提高免疫力、益智、抗衰老、抗肿瘤抗炎作用[3]，但是二至丸防治AD的物质基础鲜有人研究，且其作用的机制尚不清楚。

作为中药研究的学科前沿，网络药理学融合了系统生物学和多向药理学的思想，被应用到生命科学的多个领域，如新药靶的识别、先导化合物的发现、作用机制的研究、物质基础的筛选等[4]，以分子对接、药物靶点网络构建以及网络特征分析为基础的多靶点整体调控的思维方法，可进行中药多成分与多靶点的对接、分析。因此，利用网络药理学的手段，探究二至丸防治AD的物质基础与作用机制，既有助于解决筛选物质基础时成本高及周期长的问题，也有助于解决探寻作用机制时单靶局限性问题，便于探究二至丸的主要活性成分群和靶标群，阐述二至丸物质基础和作用机制[5]。

1材料与方法

11材料

本研究应用的软件为 DISCOVERY STUDIO中DS LibDock模块和Cytoscape 321。软件运行环境：Microsoft Windows 7 Home Basic操作系统。

12二至丸所含成分的收集

从中药系统药理学数据库（TCMSP）[6]以及二至丸的国内外文献调研，共收集得到二至丸167种（墨旱莲48种、女贞子119种）化学成分。通过TCMSP数据库下载分子结构后，导入软件DISCOVERY STUDIO进行三维结构转换、加氢处理及Minimize能量优化，结果保存为mol2文件格式。

13成分与关键蛋白对接endprint

通过对大量有关AD 发病机制文献的调研，选择了与AD发病机制相关的23 个靶蛋白 [7]，在PDB蛋白质晶体结构数据库搜索AchE，CaMKIIα，COX2等23个有复合晶体结构的关键靶点。利用DISCOVERY STUDIO对接软件，删除靶蛋白结构中的水分子，再加上极化的氢原子，赋予其正电荷，根据相关文献报道，提取位于活性口袋位置的配体小分子，暴露受体的活性口袋。其他参数设置为缺省值。利用DISCOVERY STUDIO对接软件，二至丸成分与23个靶蛋白进行柔性对接，其中打分函数选取的是LibDock Score打分函数。对接完成后，以LibDock Score 打分值为参考，筛选二至丸活性分子。

14分子对接评价方法

通过查阅相关文献，选定Dock Score≥60 [8]作为二至丸活性分子与AD关键蛋白靶点是否存在较强结合活性的评价指标，为了排除不具备类药性质的分子，使用里宾斯基（Lipinski）类药性五原则对Dock Score≥60的成分进行筛选。

15构建分子蛋白、蛋白通路作用网络图

相互作用网络图是指将彼此之间存在某种联系的分子、靶蛋白、信号通路等分子用节点（node）表示，分子与靶蛋白、靶蛋白与信号通路之间的联系用边（edge）进行表示，构成的能够显示彼此之间相互作用关系的网络图。

为了更加清晰地阐明23个关键靶点与二至丸活性分子之间的关系及其集中所在的信号通路，利用软件Cytoscape 321，以筛选所得化合物、AD关键蛋白靶点（至少与10个二至丸成分有较好的对接结果）、化合物所属药材及AD关键蛋白靶点、靶点所在信号通路作为材料，分别构建分子蛋白作用网络图和多线性组织结构型（多下属对多上级、彼此之间协同作用）蛋白通路作用网络图，其中信号通路作为靶点归属成为节点参与蛋白通路网络构建。运用Tools面板下的network analysis计算相关网络拓扑参数。

2结果

21可靠性验证

要验证所选取的23个靶蛋白的复合晶体结构是否可靠，利用DISCOVERY STUDIO软件，将原配体抽离出来，然后重新对接回复合物的活性口袋，对对接后配体的构象与原晶体结构中配体构象进行计算，得到的均方根偏差（RMSD）值得到小于2，证明该对接方法可靠，见表1 [9]。结果表明所选用的蛋白结构都比较可靠，可用于虚拟筛选。

22分子对接结果

通过筛选得到64个化合物，但这64个化合物作用的靶点数目不一，为了得到具有较高活性的化合物，选取作用靶蛋白数目≥5为指标，筛选出30个分子与5个或5个以上蛋白靶点有比较强烈的相互作用，23个分子与10个或10个以上蛋白靶点有强烈的相互作用，见表2，3。

23构建分子蛋白、蛋白通路作用网络图

根据对接筛选结果，利用Cytoscape 321软件，构建分子蛋白作用网络图，见图1。另外，发现除GLP1R外，其他22个关键靶点至少与10个二至丸成分有较好的对接结果。通过KEGG数据库，查找22个关键靶点所涉及到的信号通路，为了找寻二至丸作用效果显著的信号通路，设置参与信号通路的靶蛋白数≥3。汇总分析发现，至少有3个靶蛋白所在的信号通路有3条，分别是Wnt，MAPK，PI3KAktmTOR，见图2。

23分子靶蛋白网络特征分析

对分子靶蛋白网络的总体特征分析表明：节点数目（number of nodes）为89，平均相邻节点数（average number of neighbors）为9708，网络度（network density）为0110，网络中心度（network centralization）为0375，网络异质性（network heterogeneity）为0819。对靶蛋白信号通路网络的总体特征分析表明：节点数目为13，平均相邻节点数为1846，网络度为0154，网络中心度为0311，网络异质性为0700。结果显示，二至丸分子靶蛋白网络中既存在与β谷甾醇分子对TNFα，caspase7，CaMKIIδ，GSK3β，BchE等9个靶蛋白作用相似的1个分子对多个靶蛋白作用的现象，同时也存在与香葉醇、橙花醇、红景天苷等27个分子对AchE 1个靶蛋白作用相似的不同分子作用于同一个靶蛋白的现象，并且

PI3KAktmTOR信号通路与MAPK激酶途径、PI3KAktmTOR信号通路与非经典Wnt信号通路分别以TNFα，GSK3β靶蛋白为纽带联系在一起而不是独立分开的，这也正符合了中药多组分、多靶点协同作用的特点。

3讨论

31活性分子分析

结合分子对接结果和类药性分析，最终筛选出30个至少与5个靶点蛋白的Dock Score≥60并符合Lipinski 类药性五原则的分子，其中黄酮类有cosmetin，quercetin，3′Omethylorobol，taxifolin，eriodictyol，萜类有geraniol，betasitosterol，酚类有sinapyl alcohol，salidrosid，3，4dihydroxyphenylethyl alcohol glucoside，苯丙素类有coniferin，coniferol，烯醇类有nerol。对计算得到的二至丸与AD相关的有效物质进行了文献验证，发现女贞子中的香叶醇[10]、β谷甾醇[11]、橙花醇[12]、圣草酚[13]以及2药均有的槲皮素[14]均有相关文献报道，证明了此研究方法的合理性。由于现阶段对单体物质防治AD的研究不多，导致对接结果所显示的5个化合物并不包含墨旱莲和女贞子的特征性成分，这也说明了中药防治AD的前景广阔性。

32作用机制分析

321MAPK激酶途径MAPK是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，MAPK信号转导胞外和胞内的各种刺激引起细胞反应。这些反应包括细胞质或细胞核靶蛋白的磷酸化从而激活转录因子，进而调节基因的表达。哺乳动物的MAPK家族包括细胞外调节蛋白激酶（ERK）、cJun氨基末端激酶（JNK）和p38蛋白激酶（p38 kinases）。由靶点信号通路网络图可知，与AD相关的靶蛋白TNFα，HSP70，caspase3主要集中在JNK通路，激活MAPK激酶可以调节细胞的分化、增殖、死亡和生存[15]。田允等[16]研究表明，女贞子可通过降低caspase3的表达，减少神经元细胞的凋亡。李杰[17]的研究表明，槲皮素通过抑制p38MAPK磷酸化，阻断JNK活化，保护神经元细胞。孔祥臣[18]研究表明，槲皮素具有抑制热休克蛋白HSP70生成的作用，并对细胞凋亡有一定的保护作用。根据对接结果，16个二至丸成分都作用于这一通路，说明其可能是二至丸可通过该信号通路改善阿尔茨海默病。endprint

322非经典Wnt信号通路与经典Wnt信号通路相比无β连环蛋白参与，而是其他一些离子（Ca2+）或蛋白的参与。目前研究较多的主要包括Wnt/ Ca2+通路和Wnt/PCP（planar cell polarity）通路。由靶点信号通路网络图可知，与AD相关的

靶蛋白CaMKⅡα，CaMKⅡβ，CaMKⅡγ，CaMKⅡδ，GSK3β主要集中在Wnt/Ca2+通路，Wnt/Ca2+通路主要通过Wnt，Fz介导增加细胞内的钙离子浓度，激活蛋白激酶C和其他钙离子依赖性蛋白激酶来发挥作用 [1920]。吴婷等[21]研究表明，槲皮素通过作用于Wnt信号通路，减轻炎症反应，促进细胞存活，减轻神经毒性，对神经炎症和痴呆症有着一定的治疗作用。根据对接结果，32个二至丸成分都作用于这一通路，说明二至丸可能通过该信号通路改善阿尔茨海默病。

323PI3KAktmTOR信号通路PI3K 家族，是生长因子超家族信号传导过程中的重要分子，是一类特异性的催化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）3位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶，它与Akt 及其下游mTOR构成细胞内一个新的信号转导通路。在此信号转导通路中，各种细胞因子可以使PI3K 活化，引起Akt 活化与细胞膜结合，在PI3K 依赖激酶（PI3Kdependentkinase，PDK） 的作用下，Akt 的丝氨酸和苏氨酸残基发生磷酸化被激活，mTOR对Akt的负调节，可抑制Akt活性，在细胞质和细胞核内，参与胞内酶联反應。与AD相关的靶蛋白TNFα，Bcl2，mTOR主要集中在PI3KAktmTOR信号通路，从而调节细胞的增殖、抗凋亡、细胞迁移、囊泡转运等生物学过程[22]。屈岭等[23]研究发现，槲皮素通过作用PI3KAktmTOR信号通路，诱导自噬而减少凋亡，促进细胞增殖。但对于现有文献，未发现通过作用PI3KAktmTOR信号通路，而产生抗AD作用，但根据对接结果，35个二至丸成分都作用于这一通路，说明其可能是二至丸改善阿尔茨海默病的潜在信号通路。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，将分子计算、网络分析、文本挖掘等组合起来，多靶点、多方位、多层次地对二至丸的化学成分、作用靶点和相关疾病信号通路进行了探索性研究。研究结果初步验证了二至丸防治阿尔茨海默病的物质基础与作用机制，既体现了二至丸多成分、多靶点、协同作用的特点，也为进一步深入探讨作用机制奠定了良好基础。网络药理学作为一种新兴的药物研究手段，但还存在一定的局限性，若要将得出的结论应用于临床，尚需要药理实验研究的验证。同时，本研究未考虑药物在制作过程中可能发生的化学反应对药物成分造成的影响，也未考虑药物配伍中剂量的选择等，还需进一步深入研究探讨。

[参考文献]

[1]应侠， 吴振， 雷严，等 阿尔茨海默病的发病机制及治疗药物研究进展[J]. 中国药房， 2014（33）：3152.

[2]李林 中国阿尔茨海默病研究进展[J]. 中国药理学与毒理学杂志， 2015， 29（5）：765.

[3]蔡秀江， 黄美艳， 丁安伟，等 二至丸考源及药理作用研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志， 2011， 17（23）：272.

[4]刘志华， 孙晓波 网络药理学：中医药现代化的新机遇[J]. 药学学报， 2012（6）：696.

[5]Liu C X， Liu R， Fan H R， et al. Network pharmacology bridges traditional application and modern development of traditional Chinese medicine[J]. Chin Herb Med， 2015， 7（1）：3.

[6]Ru J， Li P， Wang J， et al. TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. J Cheminformatics， 2014， 6（1）：13

[7]陶晓倩， 张新庄， 李娜，等 网络药理学方法研究赤芍和黄柏干预阿尔茨海默病的作用机制[J]. 中草药， 2015， 46（11）：1634.

[8]李冰涛 葛根芩连汤治疗2型糖尿病的配伍规律及作用机制研究[D]. 长沙：湖南中医药大学， 2015.

[9]林卫东， 陈超， 梁生旺，等 人参皂苷改善胰岛素抵抗的网络药理学[J]. 中成药， 2016， 38（7）：1455.

[10]Perry N S L， Houghton P J， Sampson J， et al. In vitro activity of S lavandulaefolia（Spanish sage）relevant to treatment of Alzheimer′s disease[J]. J Pharm Pharmacol， 2010， 53（10）：1347.

[11]Chuu C P， Kokontis J M， Hiipakka R A， et al. Modulation of liver X receptor signaling as novel therapy for prostate cancer[J]. J Biomed Sci， 2007， 14（5）：543.

[12]Howes M J， Houghton P J， Barlow D J， et al. Assessment of estrogenic activity in some common essential oil constituents[J]. J Pharm Pharmacol， 2010， 54（11）：1521.endprint

[13]Cho J K， Ryu Y B， CurtisLong M J， et al. Cholinestrase inhibitory effects of geranylated flavonoids from Paulownia tomentosa fruits[J]. Bioorg Med Chem， 2012， 20（15）：4882.

[14]Zhang X， Jin H， Li Z， et al. Quercetin stabilizes apolipoprotein E and reduces brain Aβ levels in amyloid model mice[J]. Neuropharmacology， 2016， 108：179.

[15]张雪玲， 齐晓岚， 单可人，等 阿尔茨海默病中β淀粉样蛋白与MAPK信号通路的关系[J]. 中国老年学， 2011， 31（13）：2589.

[16]田允， 蔡晶， 陈旭征，等 补肾中药对帕金森病模型小鼠黑质纹状体神经元的保护作用[J]. 中国老年学， 2011， 31（3）：440.

[17]李杰 大黄素和槲皮素对LRRK2突变致PD果蝇的治疗作用探讨[D]. 苏州：苏州大学， 2016.

[18]孔祥臣 新型化合物FLZ对热休克蛋白的诱导作用和对实验性帕金森氏病模型多巴胺系统保护作用及机制的研究[D]. 北京：北京协和医学院， 2011.

[19]王薇， 张海廷， 王淑辉，等 阿尔茨海默病与Wnt信号通路及神经干细胞的关系[J]. 中国组织工程研究， 2013， 17（19）：3566.

[20]De A Wnt/Ca2+ signaling pathway：a brief overview[J]. Acta Biochim Biophys Sin， 2011， 43（10）：745.

[21]吴婷， 舒建洪 槲皮素对NRTI类药物引起的神经炎症的影响及其机制的初步探究[C]. 杭州：中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议， 2016.

[22]代文博， 曾亮 PI3K/Akt信号通路与阿尔茨海默病关系的研究进展[J]. 现代医药卫生， 2014（10）：1499.

[23]屈嶺， 顾蓓， 张宏，等 中药筋脉通对糖尿病周围神经组织雪旺细胞自噬与凋亡的影响[C]. 北京：全国中西医结合内分泌代谢病学术大会暨中德代谢综合征高层论坛， 2013

[责任编辑丁广治]endprint