于铁峰，刘晓静，张晓玲，郝 凤(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

氮素对紫花苜蓿根茎叶氮含量及硝酸还原酶活性的影响

于铁峰，刘晓静，张晓玲，郝 凤
(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

采用营养液砂培方法进行室内盆栽试验，以紫花苜蓿品种甘农3号(Medicagosativacv.Gannong No.3)和陇东苜蓿(Medicagosativacv.Longdong)为材料，比较研究了2种氮素形态(铵态氮、硝态氮)和5个氮素水平(0、105、210、315、420 mg/L)对现蕾期紫花苜蓿各部位氮含量及硝酸还原酶活性(NR)的影响。结果表明：2种氮素形态均能显著提高紫花苜蓿根茎叶中硝态氮含量，铵态氮含量、全氮含量及硝酸还原酶活性，且随着氮水平的提高呈先增大后减小的趋势，在210 mg/L处理达峰值。从氮素形态分析，铵态氮肥有利于铵态氮含量的增加，且根茎叶中铵态氮含量、全氮含量在铵态氮210 mg/L处理达到最大值，且显著高于其他处理；硝态氮肥有利于硝态氮含量的增加，且根茎叶中硝态氮含量、硝酸还原酶活性(NR)在硝态氮210 mg/L处理达到最大值，且显著高于其他处理。各部位中，相同氮素形态下，根茎叶中铵态氮含量、硝态氮含量、全氮含量及NR活性均表现为叶片>根部>茎部，且甘农3号表现优于陇东苜蓿。基于经济效益和生态效益考虑，铵态氮210 mg/L是培养紫花苜蓿较好的形态和水平。

铵态氮；硝态氮；紫花苜蓿；硝酸还原酶活性

氮素是作物生长必不可少的营养元素之一，既是作物最重要的结构性元素，又是作物生命代谢中必需的、最活跃的元素，同时也是作物高产、优质的重要保障。近年来，人们为追求作物的高产，氮素的施用量逐年增加，氮素利用率却没有随之提高，在玉米[1]、水稻[2]、小麦[4]、大豆[5]、黄瓜[6]、菠菜[6]等作物上的研究均表明，过量的氮素供应并不利于产量的提高及品质的提升，这不仅增加成本导致经济收益下滑，而且还会污染环境给生态效益增加负担，因此，氮素的适宜施用是解决各种问题的根本途径。植物根系吸收的氮素形态主要是硝态氮和铵态氮，其对植物的生长及生理特性影响不同，植物吸收、转化、利用不同形态氮素的能力也不同[7-8]。如水田作物水稻偏爱铵态氮，而旱地作物甜菜、大豆等则喜好硝态氮。已研究报道铵态氮可明显促进水稻的生长，表现在株高、地上部干重的显著增加[9]。硝态氮则能明显促进大豆生长及大豆幼苗及籽粒氮含量的提高，改善甜菜的营养品质，提高甜菜产糖量[10]。因此，研究氮素形态对植物的影响，对提高植物产量、改善品质有重要作用。硝酸还原酶(NR)是植物体内NO3--N同化步骤中的第1个酶，也是整个同化过程的限速酶，在植物氮代谢中起关键作用[11]。因此，NR是反映植物氮代谢能力的重要指标。

紫花苜蓿是主要的牧草饲料作物，是现代畜牧业生产中重要的植物性蛋白饲料资源，由于营养价值丰富，具有很高的经济效益，被冠以“牧草之王”的美誉[12-13]。随着现代畜牧业及奶制品产业的不断发展，现代农业经济结构的调整，其种植面积逐年增大[14]。紫花苜蓿作为豆科牧草虽可通过共生固氮固定大气中的无机氮用于自身生长发育，但根瘤固定的氮素仅占其一生需氮量的50%～60%[15]，并不能满足其生长所需，在土壤氮贫瘠的西北地区，尤其在干旱荒漠化地区[16]，补充外源氮是生产的必要保证[17]。在以高产优质为目的的生产中，要求外源氮既要满足生产需要又不对共生固氮产生抑制。因此，了解紫花苜蓿对不同形态、不同水平氮素的吸收、转化响应是提高氮肥利用率的有效途径，同时为紫花苜蓿合理施肥，减少环境污染提供理论依据。

1 材料和方法

1.1试验品种及菌株

供试品种甘农3号(Medicagosativacv.Gannong No.3)，简写为G3；陇东苜蓿(Medicagosativacv.Longdong)，简写为LD；均来源于甘肃农业大学草业学院。

供试菌株中华根瘤菌(12531)菌液，来源于甘肃农业大学草业学院。

1.2营养液配置

(1)Fahraeus无氮植物营养液：Na2HPO4·12H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，EDTA-Fe 0.007 5 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KH2PO40.1 g，Gibson 微量元素1 mL，H2O 1 000 mL，pH 6.5～7.0。

(2)Gibson微量元素液：H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO4·5H2O 0.08 g，MnSO4·H2O 1.54 g，Na2MoO4·H2O 1.17 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0[18]。

1.3试验设计

试验于2014年4月11日播种，采用营养液砂培法在甘肃农业大学室外防雨网室进行。选用长宽高为20 cm×12 cm×15 cm的花盆，花盆经75%酒精消毒后，装入经自来水反复冲洗多次，在用蒸馏水清洗3次并高压灭菌的粗砂。种子播种前进行灭菌处理，每盆均匀点播50粒灭菌种子，出苗7 d后间苗，每盆保证壮苗25株，然后浇入营养液。根据前期试验结果[19]，试验设计包括2个紫花苜蓿品种，2种氮素形态即：铵态氮、硝态氮 ，以不施氮处理为对照(CK)，2种氮素形态各设置5个氮素水平(0、105、210、315、420 mg/L)，共9个处理分别表示为，CK、硝态105、硝态210、硝态315、硝态420、铵态105、铵态210、铵态315、铵态420，每处理重复10次，共2×9×10=180 盆，完全随机排列。以Fahraeus无氮植物营养液为基本营养液，分别加入Ca(NO3)2和(NH4)2SO4配制所需氮素浓度，并调节pH为7，结合无氮营养液一同施入。

紫花苜蓿出苗7 d后开始浇灌，每次浇灌营养液前用500 mL蒸馏水淋洗花盆2次，以冲走砂基质中积累的盐分，而后浇入各处理营养液250 mL。苜蓿生长至3片复叶时，每盆均匀接种苜蓿根瘤菌液25 mL。现蕾期取样测定各指标。

1.4测定指标及方法

硝态氮含量：参照文献[20]水杨酸法测定；铵态氮含量参照文献[21]茚三酮显色法测定；全氮含量参照文献[23]用浓H2SO4-H2O2法测定；硝酸还原酶(NR)参照文献[23]方法测定。

1.5数据处理

采用Excel 2007软件进行数据的整理，应用SPSS 19.0对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1氮素对苜蓿各器官硝态氮含量的影响

试验各施肥处理硝态氮含量大于CK(P<0.05)，各处理不同器官硝态氮含量均不同，总体表现为叶片中硝态氮含量最大，根次之，茎中含量最小。2种氮素形态下，相同氮水平处理间硝态氮培养各器官的硝态氮含量高于铵态氮培养的，说明适当增加营养液中硝态氮的比例可增加植株体中硝态氮含量。同一品种中，不同氮形态，随供氮水平的增高呈先增加后降低的趋势，并且均在硝态氮210 mg/L达到峰值，除了在甘农3号根中，硝态氮210 mg/L与硝态氮315 mg/L表现为差异不显著(P>0.05)外，其他各处理间均表现为硝态氮210 mg/L显著高于其他各处理(P<0.05)。2个品种间，最优处理硝态氮210 mg/L下，甘农3号紫花苜蓿叶片中硝态氮含量达到1 043 μg/g，较对照提高了57%，较陇东苜蓿叶片硝态氮含量提高了33.9%，说明合理的硝态氮供应能明显提高叶片硝态氮含量，不同品种间存在差异(图1)。

2.2氮素对苜蓿各器官铵态氮含量的影响

各器官氮含量供氮处理均显著高于CK(P<0.05)，各器官中，叶片铵态氮含量最高，表现为叶片>根部>茎部。2个品种均随不同氮素水平的增加呈现先增大后降低的趋势，2种氮素形态表现为铵态氮素添加更有利于苜蓿叶、茎、根中铵态氮含量的积累，且在铵态氮210 mg/L时，2个品种的铵态氮含量均达最大值，并显著高于其他处理(P<0.05)。甘农3号苜蓿铵态氮210 mg/L处理下叶、茎、根铵态氮含量分别为486，388和424 μg/g，较CK分别增加98.4%，139.5%和122.0%；较陇东苜蓿铵态氮210 mg/L处理下分别增加了5.0%、9.9%、5.0%(图2)。说明铵态氮较硝态氮更利于苜蓿铵态氮含量的积累，合理的铵态氮供应能提高苜蓿叶、茎、根中铵态氮含量，不同品种间存在差异。

图1 氮素形态及水平处理下苜蓿各器官硝态氮含量Fig.1 Effects of nitrogen forms and levels on NO3--N content in various organs of alfalfa

图2 氮素形态及水平处理下苜蓿各器官的铵态氮含量Fig.2 Effects of nitrogen forms and levels on NH4+-N content in various organs of alfalfa

2.3氮素对苜蓿各器官全氮含量的影响

各施氮处理均显著高于CK(P<0.05)，说明氮素添加可以显著提高苜蓿全氮含量。2个品种的根、茎、叶中氮素含量不同，均表现为叶片中氮素含量最高，总体表现为叶片>根部>茎部。同水平氮素添加比较，甘农3号苜蓿全氮积累量好于陇东苜蓿，2种氮形态，相同氮水平相比较，除了甘农3号叶、根硝态氮315略高于铵态氮315外，其他处理均表现为铵态氮同水平高于硝态氮同水平。供试品种各硝态氮与铵态氮处理随着氮水平的增加均呈抛物线变化。全氮最高峰值均出现在氮水平为210 mg/L处，并且铵态氮210 mg/L明显好于硝态氮210 mg/L处理，且显著好于其他各处理(P<0.05)。甘农3号苜蓿铵态氮210 mg/L处理， 其叶、茎、根全氮含量分别为4.34%，2.24%和3.83%，较CK分别增加48.1%，64.7%和77.3%。较陇东苜蓿铵态氮210 mg/L处理下叶、茎、根增加了3.6%，11.4%和15.0%。说明铵态氮210 mg/L处理最利于苜蓿全氮积累(图3)。

图3 氮素形态及水平处理下2个紫花苜蓿品种不同部位的全氮含量Fig.3 Effects of nitrogen forms and levels on total nitrogen content in various organs of alfalfa

2.4氮素形态及水平对苜蓿各器官NR活性的影响

各处理NR活性在供氮处理下均显著高于CK(P<0.05)，叶片的NR活性高于根、茎器官，其活性顺序表现为：叶>根>茎(图4)。说明供氮能促使苜蓿各器官NR活性提升，且叶片硝酸还原反应最强，是最主要的氮同化器官。2品种紫花苜蓿各部位NR活性均随供氮水平的增高呈先增加后降低的趋势，甘农3号紫花苜蓿NR活性强于陇东苜蓿。2种氮素形态下，NR活性峰值均在210 mg/L出现。2氮素形态相比，硝态氮210 mg/L培养高于铵态氮210 mg/L，且显著高于其他处理(P<0.05)。最优硝态氮210 mg/L下，甘农3号苜蓿叶、茎、根中NR活性分别为37.4，31.2和36.5 μg/(g·h)，较陇东苜蓿分别增加7.5，11.4和7.7 μg/(g·h)。说明硝态氮对NR活性影响明显大于铵态氮，NR活性除受2种氮素形态的影响不同外，品种间也存在差异。

图4 氮素形态及水平处理下苜蓿各器官的硝酸还原酶活性Fig.4 Effects of nitrogen forms and levels on nitrate reductase activity in various organs of alfalfa

3 讨论

氮素是苜蓿生长发育过程中必须营养元素之一，铵态氮与硝态氮是作物吸收利用的主要的氮素形式，不同形态氮素在各器官的含量可反映作物氮素营养状况和生理功能的强弱，并不同程度的影响作物品质形成[24]。黄展飞等[25]研究表明，施肥对生长期梨叶片铵态氮变化的影响大于硝态氮。研究表明，紫花苜蓿各器官硝态氮含量、铵态氮含量在210 mg/L下达到峰值，且铵态氮肥利于铵态氮含量的增加，硝态氮肥利于硝态氮含量的增加。从各器官氮含量分析，均表现为叶片>根部>茎部。说明在营养生长阶段，紫花苜蓿的叶片是氮累积的中心，根次之。分析原因多是由于各器官对氮素的吸收、转运和利用不同，进而造成氮积累的差异。张英鹏等[26]利用水培法研究了不同供氮水平对菠菜硝酸盐及各器官含量的影响，试验结果为叶片氮含量>叶柄氮含量，氮素4～8 mmol/L，叶片硝酸盐含量呈降低趋势，与试验研究基本一致。

紫花苜蓿作为一种重要的植物蛋白饲料，其全氮含量能直接反应自身的营养价值，甚至经济价值，施肥是提升苜蓿营养价值的一项重要技术[27-28]。研究表明，2种形态的氮素添加均能增加现蕾期苜蓿根、茎、叶等器官的氮含量，且在210 mg/L下达最大值。胡华锋等[29]对黄河滩区紫花苜蓿的研究也表明，适当的氮素添加可显著提高苜蓿氮含量，尤其是叶、茎器官的氮含量，且随施氮量增加，苜蓿地上部氮含量呈先增加后降低的趋势。在试验中各器官呈现叶片>根部>茎部的规律；相同的氮水平下，铵态氮培养要优于硝态氮培养。李灿东等[30]对大豆的研究结果与此次试验结果基本一致。叶片和茎作为家畜采食的主要部位，其氮含量越高，营养价值越高。此次研究中在铵态氮210 mg/L处理下茎中的全氮含量最高，而叶和根中则在铵态氮315 mg/L处理最好，但过多的氮素添加会给经济效益和生态效益带来负担，因此，基于这两方面考虑，铵态氮210 mg/L是培养紫花苜蓿较好的形态和水平。

硝酸还原酶是植物氮代谢的关键酶[31]，其活性对调节植物体内硝态氮同化水平和蛋白质合成具有重要意义[32-33]。氮素水平是影响NR活性的主要原因之一，杜永成等[34]研究了4个硝态氮添加水平(N0、60、120、180 kg/hm2)对甜菜NR活性的影响，结果表明硝态氮120 kg/hm2可显著提高甜菜NR活性。张智猛等[2]研究表明，施氮水平明显影响花生的蛋白含量及NR活性，适量施氮(45～90 kg/hm2)可使花生各营养器官中NR活性提高，尤其氮素水平对花生叶片NR影响较大，对茎和根中活性大小的影响则较小。研究表明，不同氮水平下现蕾期苜蓿各器官NR活性均表现为叶>根>茎，在硝态氮210 mg/L处理下，NR活性达到峰值，并显著高于其他处理(P<0.05)。NR活性与氮素形态关系也很密切，试验表明，紫花苜蓿现蕾期，硝态氮对NR活性影响明显大于铵态氮。陈煜等[35]对大豆利用硝态氮、铵态氮及混合态氮对4个大豆品种进行氮素诱导处理，结果表明硝态氮对提高4个品种NR活性效果最好，铵态氮的效果较差，与本文研究结果一致。究其原因可能与NO3-是NR的底物和诱导剂有关，而NH4+的诱导效果不如NO3-，可能是NH4+作为NO3-两步还原反应的终产物所产生的反馈抑制作用所致[36-37]。

4 结论

2种氮素形态显著提高紫花苜蓿根茎叶中硝态氮，铵态氮、全氮含量及硝酸还原酶活性(P<0.05)，而且，随氮水平的提高呈单峰曲线的变化趋势，在210 mg/L处理达峰值。从氮素形态分析，铵态氮肥有利于铵态氮含量的增加，且在210 mg/L处理下，根，茎和叶中铵态氮、全氮含量达最大值，显著高于其他处理(P<0.05)；硝态氮肥有利于硝态氮含量的增加，且在210 mg/L处理下，根茎叶中硝态氮含量、硝酸还原酶活性(NR)达到最大值，显著高于其他处理(P<0.05)。从各部位分析，相同氮素形态下，根茎叶中铵态氮含量、硝态氮含量、全氮含量及NR活性均表现为叶片>根部>茎部，且甘农3号表现优于陇东苜蓿。基于经济效益和生态效益考虑，铵态氮210 mg/L是培养紫花苜蓿较好的形态和水平。

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Effectsofnitrogenonnitrogencontentandnitratereductaseactivityinrootstemandleafofalfalfa

YU Tie-feng,LIU Xiao-jing,ZHANG Xiao-ling,HAO Feng

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofPrataculturalEcosystem,MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-USCenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

The nitrogen content and nitrate reductase activity (NR) in alfalfa organs were studied based on 2 nitrogen forms (nitrate nitrogen and ammonium nitrogen) and 5 nitrogen levels (0,105,210,315,420 mg/L).Two cultivars,Medicagosativacv.Gannong No.3 andMedicagosativacv.Longdong,were selected as materials at squaring stage,and the experiment was conducted outdoors(in flashing net room) using sand culture method.The results showed that the content of NO3--N,the content of NH4+-N and total nitrogen content in root and stem and leaf of alfalfa under two nitrogen treatments were significantly higher (P<0.05),and showed a trend of increased first and then decreased with the increase of nitrogen level,peaked at 210 mg/L.The content of NO3--N,the content of NH4+-N and total nitrogen content in root,stem and leaf of alfalfa under 2 nitrogen treatments were significantly higher (P<0.05),and showed a trend of increased first and then decreased with the increase of nitrogen level,peaked at 210 mg/L.NH4+-N was beneficial to content of NH4+-N,The content of NH4+-N and total nitrogen content reached peak and significantly higher than other treatments (P<0.05) at the NH4+-210;The content of NO3--N and the nitrate reductase activity reached peak and significantly higher than other treatments (P<0.05) at the NO3--210;Analysis of organ,the maximum of the contents of ammonium nitrogen,nitrate nitrogen,total nitrogen and NR were found at leaves,minimum in stem under the same nitrogen form,and Gannong No.3 was better than that of Longdong.Based on the economic benefit and ecological benefit,the NH4+-210 was better.

NH4+-N；NO3--N；alfalfa；nitrate reductase activity

S 541.9

A

1009-5500(2017)05-0014-07

2017-03-08；

2017-03-21

公益性行业(农业)科研专项(201403048-8)；国家自然科学基金项目(31460622)；甘肃省科技支撑项目(1504NKCA003)资助

于铁峰(1983-)，男，黑龙江省宝清县人，在读博士研究生。

E-mail：yutiefeng520@163.com

刘晓静为通讯作者。